禾谷镰刀菌候选G蛋白偶联受体基因和AMD1基因的功能研究

摘要

禾谷镰刀菌是世界很多地区小粒谷物作物和玉米的重要病原菌。不仅造成严重的产量和经济损失，侵染的谷物还会被其产生的毒素污染对人畜健康造成很大的威胁。G蛋白偶联受体（GPCRs），膜受体蛋白，识别和介导不同的细胞外环境信号做出迅速的反应，在调控真菌生长、发育、营养识别、交配、侵染和毒性过程中起到重要的桥梁作用。可能的GPCRs已经在镰刀菌基因组比较中预测出来，而禾谷镰刀菌中GPCRs的系统分析还没有被报道。首先，我们获得了85个GPCRs基因敲除突变体并且对所有突变体的生长、产孢、有性生殖、侵染进行了分析。3个GPCRs基因缺失突变体对小麦的侵染能力降低，另外三个3个GPCRs基因（PRE1、CRL1、CRL2）分别调控子囊壳的大小、子囊壳的形成、子囊的发育。可能是由于GPCRs基因功能的冗余，所有敲除突变体菌丝生长正常并且不影响产孢量。对crl1和crl2的进一步研究发现CRL1的缺失不影响菌丝融合，与mat1-1-1杂交，作为父本时可育，伤口或小麦茎节可以诱导crl1子囊壳前体的产生，而且表达CRL1的ORF区不能互补突变体子囊壳产生的缺陷，而crl1突变体中表达包括CRL1及其3’UTR区可以产生正常的子囊壳并发育正常的子囊孢子。crl2突变体可以产生正常的子囊壳，但子囊的发育存在严重缺陷，有性诱导8d后观察发现没有完整的子囊发育出来，核荧光结果显示发育缺陷的子囊内有且仅有1个细胞核，因此CRL2基因的敲除使得有性生殖停留在了产囊丝钩阶段。
　　RNA-seq结果显示CRL1在有性诱导1 d后已经开始表达，逐渐升高，到第4 d时表达量最高，与其表型表现出来的子囊壳产生受阻一致；不同的是，CRL2在有性诱导3 d后开始表达，并随着有性发育的推进表达量一直升高，因此相比于crl1阻止有性诱导前期发育，crl2则使得有性发育停止在了中后期子囊的发育，而且Crl2-GFP定位信号开始于有性诱导后4 d的子囊膜上也吻合了Crl2在有性时期功能的调控阶段在有性诱导4 d子囊开始发育的时间。外源cAMP不能恢复突变体crl1和crl2的表型，crl1，crl2突变体中PDE2基因的敲除（既增加细胞内cAMP的水平）也不能互补突变体的表型，说明CRL1、CRL2介导的信号传递过程对有性生殖的调控不依赖于细胞内保守的cAMP-PKA信号通路。
　　禾谷镰刀菌的子囊孢子作为小麦赤霉病的初侵染源，当温度湿度适宜附着在小麦穗部萌发侵染开始。前面关于GPCRs基因CRL1、CRL2分别在有性发育前期和中期调控有性生殖，而转录组数据表明同样编码跨膜蛋白的基因AMD1在有性发育后期特异表达，我们的研究结果也说明AMD1基因的缺失影响子囊后期的成熟及子囊孢子的释放。而且不影响无性生长和产孢量这与AMD1在有性生殖后期特异的表达一致。有性诱导8 d或更长的时间子囊壳压开发现子囊孢子散乱的堆积在一起，而子囊孢子形态正常。与Fgkin1和gea1突变体类似，amd1突变体子囊壳内散乱的子囊孢子会在一端萌发，定量结果也表明Fgkin1突变体中AMD1的表达量下调5倍多。Liu等在禾谷镰刀发现RNA编辑并且特异的发生在有性时期，AMD1基因是其中一个ORF区有一个提前终止密码子被编辑的基因，被编辑之后才能编码完整的蛋白。AMD1编码一个有MFS(major facilitator superfamily)结构域和11 TM(transmembrane helixes)结构域的蛋白。本研究中，我们进一步研究了AMD1基因的功能及UAG到UGG编辑发生的作用。amd1突变体中表达基因组上的AMD1基因（我们称之为野生型AMD1）和编辑过的AMD1形式可以互补突变体在子囊孢子释放和子囊孢子萌发的缺陷。而没有被编辑的形式表型缺陷与突变体相似。过表达也可以互补突变体的缺陷。RP27启动子过表达AMD1对禾谷镰刀菌的生长及无性发育没有什么影响。另外，Amd1-GFP融合表达发现Amd1定位在子囊膜上，而且Amd1仅在子囊果形成的真菌中出现。有趣的是，AMD1的缺失造成一些与转运蛋白或膜相关蛋白表达亮上调。总之，这些结果表明Amd1定位在子囊膜上对维持子囊壁的完整性至关重要，而且AMD1转录形式的A-to-I RAN编辑对于子囊孢子的喷发及子囊孢子萌发自我抑制是十分重要的。

目录

声明

第一章 前言

1.1 禾谷镰刀菌

1.2 禾谷镰刀菌的有性生殖

1.3 G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）

1. 4 禾谷镰刀菌中GPCRs研究的现实意义

第二章 实验材料与步骤

2.1 实验材料

2.2 实验步骤

第三章 禾谷镰刀菌GPCRs基因的预测及功能分析

3.1 禾谷镰刀菌中GPCRs基因的预测及分类

3.2 GPCRs基因的表达模式

3.3 禾谷镰刀菌中候选GPCRs基因的敲除及突变体的表型分析

第四章 CRL1和CRL2 对有性发育的调控

4.1 CRL1, CRL2 有性时期特异表达

4.2 突变体crl1不影响菌丝融合并且父本可育

4.3 CRL1调控有性生殖前期的发育

4.4 突变体crl2影响产囊丝钩(crozier)的进一步发育

4.5 CRL1和CRL2不同形式的突变对其功能的影响

4.6 Crl1，Crl2下游通路研究

第五章 RNA编辑基因AMD1对有性发育的影响

5.1 AMD1基因的进化及生物信息学分析

5.2 amd1突变体的获得及表型分析

5.3 AMD1的表达模式

5.4 A632-to-I编辑对AMD1基因功能的影响

5.5 AMD1与子囊孢子萌发自抑制

5.6 AMD1在转录水平的调控

第六章 全文总结及分析

6.1 GPCRs功能研究总结

6.2 AMD1研究总结

参考文献

附录

英文缩写表

致谢

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