紫花苜蓿细胞分裂素氧化酶基因(MsCKX)的克隆及初步功能分析

摘要

紫花苜蓿(Medicago SativaL.)作为优质的豆科牧草，在畜牧业发展中占据着重要的地位。但是在我国，紫花苜蓿种植面积最大的西北地区降水量少，土壤盐碱化等环境因素导致了紫花苜蓿产量较少，品质偏低的后果，严重制约了畜牧业的发展。因此，培育出优良、抗逆性强的紫花苜蓿品种势在必行。有研究表明，细胞分裂素氧化酶基因作为一种逆境响应因子参与植物的抗逆反应。研究细胞分裂素氧化酶基因的相关功能，利用人工手段控制紫花苜蓿內源细胞分裂素水平，是对紫花苜蓿抗逆性进行改良的一种有效的生物技术策略。本研究利用同源克隆法克隆了紫花苜蓿细胞分裂素氧化酶基因MsCKX，并利用生物信息学软件对其进行序列分析，对其分子功能进行了推测；利用实时荧光定量技术分析了MsCKX基因在干旱、盐以及ABA等不同处理下在不同组织中的表达模式；构建了植物过表达载体 pCAMBIA1302-MsCKX，利用农杆菌介导法将其导入到拟南芥中，成功获得了MsCKX转基因拟南芥植株，并对转基因拟南芥进行了初步功能的研究。现将主要研究结果如下： 1.紫花苜蓿MsCKX基因的cDNA全长为1833 bp，包含1530 bp的开放阅读框，编码509个氨基酸残基。信号肽预测显示MsCKX基因编码蛋白不含有信号肽，可能在细胞质中行使功能。对其保守结构域分析发现其氨基酸残基可以构成CKX家族共有的核心功能域：细胞分裂素、FAD以及细胞分裂素氧化酶I结合域，结合FAD/FMN的脱氢酶保守域以及与FAD连接的氧化还原酶保守域。 2.紫花苜蓿MsCKX基因在根和叶片中均有表达，并且在叶片中表达量最高，是根中表达量的16倍。经ABA, NaCl及干旱处理后发现，MsCKX基因的表达会随着组织及环境刺激的不同发生不同的变化，表达模式及表达量变化幅度较大。但是不论怎么变化， MsCKX基因对各种胁迫都有响应，说明MsCKX基因可能会参与ABA, NaCl及干旱胁迫的调节过程。 3.对转基因拟南芥 T3 代植株在种子萌发和非生物抗性 (抗旱和耐盐) 两方面进行初步功能的验证发现，MsCKX 基因对种子萌发具有负调控作用，延迟了其萌发并通过促进根的生长来提高了其耐盐性和抗旱性。 综上所述，本研究通过生物信息学、表达模式研究以及转基因分析，验证了紫花苜蓿MsCKX基因初步的功能，为后期紫花苜蓿的抗逆研究奠定了一定的基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1细胞分裂素氧化酶

1.2细胞分裂素氧化酶基因(CKX基因)

1.3研究目的及意义

1.4 研究内容

1.5 研究技术路线

第二章 紫花苜蓿MsCKX基因的克隆及序列分析

2.1 试验材料

2.2 MsCKX基因中间片段的克隆

2.3 RACE技术克隆MsCKX基因的全长

2.4 结果与分析

2.5 小结

第三章 紫花苜蓿MsCKX基因的表达分析

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3结果与分析

3.4小结

第四章 紫花苜蓿MsCKX基因过表达载体的构建

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3结果与分析

4.4 小结

第五章 紫花苜蓿MsCKX基因的拟南芥转化及初步功能验证

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

第六章 讨论及结论

6.1 讨论

6.2 结论

6.3 本研究创新点

6.4 展望

参考文献

附录

致谢

作者简介