缬草内生、根际放线菌中安莎类和卤代类抗生素生物合成基因簇的筛选及研究

摘要

药用植物内生及根部微生物种类、数量以及活性代谢产物相对比较丰富，是生物活性物质的重要来源。本研究旨在分离缬草内生及根际放线菌，筛选其中含安莎霉素类和卤代酶类抗生素生物合成基因簇的菌株，挖掘鉴定新的次级代谢产物。 本研究通过分离纯化共获得143株缬草内生及根际放线菌，检测其对细菌和真菌病原菌的抑菌活性，结果显示22.4%的放线菌对病原菌具有抑制效果。基于AHBA合酶基因和卤代酶基因设计安莎类和卤代类抗生素简并引物，对抑菌效果较好的菌株DNA进行PCR扩增。结果表明：菌株AJ21和AJ56分别含有安莎类和卤代类抗生素生物合成基因。通过对两株菌进行16S rDNA鉴定、形态特征观察、生理生化研究以及系统发育分析，发现菌株AJ21和AJ56均为链霉菌属。 基于菌株AJ21和AJ56的抑菌效果以及抗生素生物合成基因片段，进行基因组分析发现：菌株AJ21的基因组序列长约10 Mb，有8415个编码基因，GC含量达到73.73%。菌株AJ56的基因组序列长约8 Mb，有7259个编码基因，GC含量为71.85%。基因功能分析发现两者均含有特曲霉素抗性，并拥有丰富的次级代谢基因簇，其中菌株AJ21有54个，菌株AJ56有36个。 综上所述，发现菌株AJ21的抑菌活性较好，含有丰富的次级代谢产物。通过优化发酵培养基和发酵天数，对其进行大量发酵萃取，检测结果显示萃取液对枯草芽孢杆菌有很好的抑菌效果。通过对分离纯化的萃取物进行HPLC检测和质谱检测，初步确定菌株AJ21的次级代谢产物中含有放线菌素D。 菌株AJ56含有丰富的次级代谢基因簇，在萘啶酮酸终浓度为100μg/mL和Apr终浓度为1.2μg/mL条件下，构建了菌株AJ56与S17-1/pSET152以及与S17-1/pKC1139遗传转化系统，为后续挖掘其潜在的次级代谢产物提供了试验基础。

目录

第一章 综述

1.1药用植物概述

1.2缬草简介

1.3根际放线菌的研究

1.4内生菌的研究

1.5次级代谢产物的研究及意义

1.6研究依据、目的及意义

第二章 含安莎类和卤代酶类菌株的筛选及鉴定

2.1材料

2.2方法

2.3结果与分析

2.4结论与讨论

第三章 菌株AJ21和AJ56的基因组分析

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.4结论

第四章 菌株AJ21的发酵萃取及放线菌素D的发现

4.1材料

4.2方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章 菌株AJ56的遗传转化系统构建

5.1材料

5.2方法

5.3结果与分析

5.4讨论

第六章 总结

参考文献

附录

致谢

作者简介