新城疫病毒通过血脑屏障入侵鸡中枢神经系统的研究

摘要

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种严重的禽类传染病。NDV属于副黏病毒科，禽副黏病毒属，又称禽副黏病毒血清1型 (APMV-1)。它会引起禽类的呼吸道、消化道疾病及神经系统紊乱。根据强毒株感染鸡的临床病理特征分为两种类型：嗜神经型和嗜内脏型。普遍认为NDV感染鸡所引起的严重神经症状是由于病毒穿过血脑屏障(The blood-brain barrier ， BBB)侵入了中枢神经系统(Central nervous system，CNS)，NDV是如何通过BBB的至今未知。本研究通过建立鸡脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells，BMECs)培养的血脑屏障体外模型探究病毒入侵CNS的作用机制，为NDV的防控提供有价值的线索。本论文的主要研究结果如下： 1. NDV感染鸡中枢神经系统 通过点眼滴鼻和颅内途径对SPF鸡感染强、弱毒株，嗜神经强毒株F48E9在高、中、低剂量感染组均比颅内感染组的鸡出现神经症状和死亡延迟一天，且在CNS（大脑，小脑和脊髓）中能够有效复制。而感染弱毒株LaSota的鸡无明显临床症状且在CNS中未检测到病毒。这些结果表明嗜神经强毒株侵入CNS系统是引起鸡的神经症状的关键因素。 2. NDV感染对鸡脑渗透性的影响 将4周龄的SPF鸡分别感染强毒株F48E9和弱毒株LaSota，并设立PBS为正常对照组，利用示踪剂荧光素钠（NaF）检测脑的渗透性，结果显示脑组织中（包括大、小脑）均有示踪剂的渗入。感染弱毒株组和对照组均未发现临床症状和示踪剂的渗入。说明强毒株改变了鸡脑部的渗透性，而弱毒株对鸡脑部的渗透性无影响。 3. 鸡BBB体外模型的建立 16-19日龄鸡胚取全脑，利用Percoll梯度离心并用嘌呤霉素处理进行分离鸡的原代BMECs，用内皮细胞的特异性分子CD31进行BMECs的鉴定，将细胞培养于双层细胞培养板Transwell中，建立了BBB的体外模型。 4. NDV对鸡BBB 渗透性的影响 通过强、弱毒株感染鸡BBB体外模型，强毒株F48E9可在鸡BMECs中有效复制，但弱毒株LaSota的复制能力较弱。利用示踪剂检测的结果显示，感染强毒株NaF会大量溢出，而感染弱毒株几乎没有NaF溢出。这些结果表明，只有强毒株能够在鸡BMECs中有效复制，并可能通过破坏BBB的完整性而增加了其渗透性。利用转胞吞作用抑制剂Dynasore处理的结果显示，感染强毒株组NaF的溢出量在12h时极显著低于未处理的对照组，而弱毒株LaSota感染组NaF的溢出量无变化，表明Dynasore对强毒株在早期影响BBB的渗透性方面有抑制作用。 5. Dynasore对鸡感染NDV的抑制作用 在强毒株感染SPF鸡之前，肌肉注射不同剂量的Dynasore均比未给药组延后出现临床症状，但仍全部死亡。低抗体水平商品鸡在感染强毒株前、后以及发病后再肌肉注射Dynasore，发现感染前给药有个别动物出现神经症状，但无死亡出现。而感染后以及发病后再给药均出现临床症状和死亡。这些结果表明，Dynasore对NDV感染低抗体（HI为22-24）的鸡能起到预防保护作用。 综上所述，NDV嗜神经性强毒株能增强鸡脑渗透性，并增强了鸡BBB体外模型的渗透性；Dynasore能早期抑制强毒株对BBB渗透性的改变，且对NDV感染低抗体水平（HI为22-24）的鸡能起到预防保护作用，其与抗体的协同作用机制有待研究。本研究为揭示NDV入侵CNS的机制和研发防治NDV的药物提供了基础资料。

目录

声明

第一章 新城疫病毒侵染鸡中枢神经系统的研究进展

1.1新城疫

1.1.1新城疫病毒（NDV）

1.1.2 NDV的致病性

1.2 血脑屏障的基本生物学特性

1.2.1血脑屏障

1.2.2 BBB的分子性质

1.2.3血脑屏障与神经性疾病的关系

1.2.4血脑屏障与病毒的关系

1.3转胞吞作用抑制剂Dynasore

1.3.1 Dynasore的结构与功能

1.3.2 Dynasore对病毒的作用

第二章 NDV通过血脑屏障侵入鸡中枢神经系统的机制

2.1 材料

2.1.1 病毒

2.1.2 鸡胚及动物

2.1.3 主要仪器

2.1.4 试剂配制

2.2 方法

2.2.4 动物组织采集与处理

2.2.5伊文斯兰试验

2.2.6 荧光素钠试验

2.2.7 病毒滴度

2.2.8 鸡脑微血管内皮细胞原代培养及验证

2.2.9 BBB体外模型的构建及感染NDV

2.3 结果

2.3.1 鸡NDV自然感染

2.3.2 NDV对鸡脑渗透性的影响

2.3.3 颅内及自然感染不同剂量NDV鸡的临床特征

2.3.4 颅内及自然感染不同剂量NDV后组织病毒滴度

2.3.5 BBB体外模型的建立及预处理

2.3.6 BBB体外模型感染NDV

2.3.7 Dynasore对NDV感染BBB渗透性的影响

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 Dynasore对NDV感染鸡的抑制作用

3.1 材料

3.1.1病毒、动物

3.1.2 主要试剂

3.1.3 试剂配制

3.1.4 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 病理变化评价

3.2.2抗体水平测定

3.2.3 组织病毒滴度测定

3.3 结果

3.3.1 Dynasore对NDV感染SPF鸡的影响

3.3.2 Dynasore剂量及作用时间在SPF鸡上的评估

3.3.3 Dynasore对非免商品鸡感染NDV前后给药的影响

3.3.4 Dynasore对低抗体水平商品鸡感染NDV的影响

3.3.5 Dynasore对肌肉注射及自然感染NDV的影响

3.3.6 Dynasore剂量及给药时间在商品鸡感染NDV的效果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

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