利用核酶自剪切机制建立HCV稳定分泌细胞模型和小鼠模型

摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体。全球HCV的感染率约为3％，近1.7亿人感染HCV[1]。我国约为5000万人，并且年发病人数呈高速上升趋势，2009年发病人数比2003年上升了534％，达到131849人。HCV感染易慢性化[2]，其慢性化率可高达70％，部分慢性丙型肝炎患者最终可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌。目前临床上主要采用干扰素和利巴韦林联合治疗丙型肝炎，但该疗法并非对所有慢性丙型肝炎患者均有效，约50％患者不能产生持续病毒学应答(SVR)，其中Ⅰ型HCV感染患者SVR率最低[3，4]。因此，亟需寻找新的抗HCV药物靶点和研制新的抗HCV药物。长期以来，由于一直缺乏有效的HCV体外培养模型和小动物模型严重阻碍了HCV致病机制的研究、抗HCV药物体内作用效果的评价和保护性疫苗的研发。因此探索建立有效的HCV模型，包括HCV体外培养细胞模型和HCV小动物模型，具有十分重要的意义。
　　 就目前国内外的研究成果来看，HCV体外培养细胞模型主要采用的是2005年日本学者Wakita等人[5]建立的体外转录模型，该模型存在操作繁琐、稳定性差等缺陷，限制了它的应用。HCV小动物模型进展比较缓慢，比较成功的是人肝嵌合uPA-SCID小鼠模型[6]，但是由于该小鼠出生时肝脏损伤严重，致使成活率较低，而用于移植的人肝又不易获得，这使该模型局限于少数实验室的应用，无法满足日趋紧迫的HCV研究的需要。
　　 正是基于以上的原因，本研究建立了一种基于核酶自剪切机制的稳定分泌HCV细胞模型，并用核酶自剪切载体对HCV小鼠模型进行了探索性研究。
　　 具体研究内容和结果如下：
　　 1、HCV蛋白多克隆抗体的制备。根据实验的需要，原核表达六个HCV不同的蛋白片段，以表达纯化的蛋白为抗原，分别免疫新西兰大耳白兔，收集血清，制得六个针对HCV不同蛋白片段的多克隆抗体。
　　 2、HCV核心蛋白表达载体的构建。根据实验的需要，在真核表达载体pEGFP-N1多克隆位点(MCS)前引入原核启动子lac promoter序列，得到穿梭表达载体pEGFP-N1-lac，再把PCR扩增出的HCV核心蛋白序列(573bp)插入到构建的穿梭表达载体MCS区，得到重组质粒pEGFP-N1-lac-core，该质粒在原核细胞(E.coli)和真核细胞(HepG2)中均能表达HCV核心蛋白，可以作为实验中HCV蛋白检测的阳性对照。
　　 3、重组质粒pJFH1/GDD-2RB的构建。应用突变PCR的方法，在原始克隆pJFH1/GDD的HCV全长基因组cDNA的两端各加入一个核酶序列，并通过合适的酶切位点把两端含有核酶的HCV全长cDNA连接到真核表达载体pEGFP-N1的CMV启动子下游，得到目的质粒pJFH1/GDD-2RB。此外，将上述重组质粒pJFH1/GDD-2RB中HCV NS5B基因(编码产物为RNA依赖的RNA聚合酶)中GDD的碱基序列突变为GND，使表达产物失去RNA聚合酶活性，得到阴性对照质粒pJFH1/GND-2RB。
　　 4、质粒转染HepG2细胞及稳定细胞系的筛选。pJFH1/GDD-2RB及其对照质粒pJFH1/GND-2RB转染HepG2细胞后，加入G418溶液至终浓度为0.7mg/ml(为预实验确定的最佳筛选浓度)，对转染细胞进行加压筛选。2个星期后，每孔均有大量细胞死亡，但是整合入转染质粒的细胞存活下来并分裂增殖。随后采用有限稀释法把存活下来的细胞倍比稀释铺于96孔板，最后挑取单克隆进行扩大培养，其中pJFH1/GDD-2RB稳定克隆命名为HepG2/GDD，pJFH1/GND-2RB稳定克隆命名为HepG2/GND。
　　 5、细胞培养上清中HCV RNA的检测。根据深圳匹基公司HCV PCR荧光定量检测试剂盒操作流程，提取细胞培养上清中的RNA，提取的RNA经RNase-freeDNaseⅠ处理，以去除基因组DNA的污染。然后经过酚抽得到纯净的RNA，按照试剂盒配制25μl反应体系，应用Roche Lightcycler2.0完成反应。结果显示HepG2/GDD培养上清中含有HCV RNA，参照标准品，其滴度达到1×107，阴性对照(HepG2/GND培养上清)和空白对照(水)中均没有检测到HCV RNA。
　　 6、间接免疫荧光检测HCV核心蛋白的表达。消化细胞HepG2/GDD和原始HepG2细胞(空白对照)，铺于抗原片上，待细胞贴壁后，用37℃预温的1×PBS洗3次，每次10min，然后用4％的多聚甲醛(PBS稀释)室温固定30min，洗涤(洗涤方式同上)。再用0.2％Triton X-100(PBS稀释)浸泡5min以增强细胞膜的通透性，洗涤。用山羊血清室温封闭固定好的细胞30min，PBS清洗后，加入1:400稀释的抗HCV核心蛋白单抗，37℃孵育1h，洗涤，加入1:1000稀释的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，洗涤后加入含有DAPI(4'，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)的封片剂，荧光倒置显微镜下观察到HepG2/GDD细胞胞浆区域有较强荧光出现，而空白对照则无此现象，由此表明，HepG2/GDD细胞中有HCV核心蛋白表达。
　　 7、蛋白免疫印迹检测HCV核心蛋白的表达。收集HepG2/GDD和原始HepG2细胞，裂解缓冲液裂解后离心取上清，按照4:1的体积比加入5倍上样缓冲液，沸水浴15分钟。上样进行SDS-PAGE电泳，之后转至PVDF(聚偏氟乙烯膜)膜上，5％脱脂牛奶37℃封闭2h，抗HCV核心蛋白单抗4℃孵育过夜，HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG37℃孵育1h，ECL显色，暗室内曝光于胶片上，观察到HepG2/GDD泳道有条带产生，大小与阳性对照相似，而空白对照(HepG2细胞)无条带呈现。
　　 8、HCV病毒颗粒的电镜观察。收集HepG2/GDD细胞培养上清(约15ml)，慢慢搅动并加入NaCl至终浓度0.5mol/L，再加入PEG6000至终浓度为10％，4℃过夜。8000rpm离心30min，收集沉淀，溶于100μl PBS中。用细滴管吸取一滴样品悬液，滴于铜网上，进行负染操作。完成负染后，置于电子显微镜(Philips，TECNAI-10)下，观察到HCV颗粒，直径约为55nm。
　　 9、干扰素治疗。把HepG2/GDD细胞铺于6孔细胞培养板中，加入不同剂量的IFN-α至终浓度为10U/ml、100U/ml、500U/ml。3d后收集细胞上清，提取RNA，实时定量PCR检测病毒滴度，发现病毒滴度随干扰素浓度升高而降低，预示该细胞模型可以用来抗HCV药物的筛选。
　　 10、HCV转染小鼠模型探索研究。通过高压水动力法把质粒转染入C57小鼠肝脏细胞，3天后处死小鼠，收集血清并取肝。用实时定量PCR的方法没有检测到血清中含有HCV RNA，免疫组化检测小鼠肝脏中HCV核心蛋白发现，在血管周围细胞中有HCV核心蛋白表达。
　　 通过上述一系列的研究，我们成功构建了质粒pJFH1/GDD-2RB，通过把该质粒转染HepG2细胞，然后G418加压筛选，获得了整合有该质粒的细胞系HepG2/GDD，该细胞系能够有效表达HCV核心蛋白，实时定量PCR检测上清液中HCV滴度达到1×107，电镜观察HCV直径为55nm。应用经IFN-α治疗发现上清液中病毒滴度随干扰素-α浓度的升高而降低。在随后开展的HCV转染小鼠模型探索研究中发现，小鼠血清中没有HCV颗粒，但是免疫组化证明，小鼠肝细胞中有HCV核心蛋白的表达，这为我们深入开展小鼠模型研究打下良好的基础。