犬骨髓EPCs与MSCs的荧光标记及组织工程羊膜贴片的构建

摘要

在过往的组织工程研究中已经证实，由犬骨髓内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）和骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）共同构建的组织工程构建体可以有效地修复缺损和病变的组织。然而不同研究之间，疾病的病因、细胞移植的时机、移植的剂量、递送的途径和移植终点的选择不同，都可能导致不同的结果。因此细胞体外标记后完成的组织工程构建体应用于后期移植，可以帮助干细胞组织工程研究实现体内分化示踪，更好地了解干细胞的修复行为。目前国内在细胞体外标记技术的研究和应用领域已有许多成果，但是标记细胞应用于体内长期示踪的效果以及EPCs难以荧光标记的现状，还没有得到有效地解决方法。 针对这些问题，本研究通过荧光染料和携带荧光蛋白基因的慢病毒转染EPCs和BMSCs，在保证细胞体内长期示踪要求的同时，克服荧光蛋白标记EPCs的难点；探究转染后RFP-EPCs和GFP-BMSCs的增殖活性；摸索制备人羊膜脱细胞基质的方法，利用组织学、扫描电镜等检测脱细胞羊膜基质的生物相容性，探究 RFP-EPCs和GFP-BMSCs在脱细胞羊膜上生长的可行性，明确了组织化工程羊膜贴片的特性，得到试验结果如下： 1. 对比四种慢病毒介导的荧光蛋白基因转染犬骨髓 EPCs的效率，筛选出以pLVX-mcherry-IRES-puro转染的EPCs，得到荧光标记阳性率达90%以上并可稳定遗传的RFP-EPCs； 2. 摸索出反复冻融-SDS-DNA酶法，制备得到无细胞残留、三维结构完整、柔韧性较强、生物相容性良好的人脱细胞羊膜基质，作为理想的组织工程支架材料； 3. 选用阳性率极高，荧光强度适宜的RFP-EPCs和GFP-BMSCs结合脱细胞羊膜基质，构建得到细胞增殖活性良好、贴附良好、混合生长分布均匀、可应用于体内修复示踪的组织工程化羊膜贴片。 综上所述，本研究通过对比得到了能高效率转染犬骨髓EPCs的荧光蛋白基因pLVX-mcherry-IRES-puro和不影响其增殖活性的转染方案，同时得到转染率极高、荧光 强度适宜的RFP-EPCs和GFP-BMSCs；结合“反复冻融-SDS-DNA酶”法制备的脱细胞羊膜基质，共同构建了增殖活性良好、贴附良好、混合生长分布均匀、可应用于体内修复示踪的组织工程化羊膜贴片。

目录

声明

第一章 细胞体外标记的研究进展

1.1 细胞标记方式的发展应用

1.2 病毒载体转导的研究进展

1.3 荧光蛋白标记细胞的研究现状

第二章 EPCs或/和MSCs与脱细胞羊膜支架在组织工程中的应用

2.1 MSCs在组织工程中的应用

2.2 内皮祖细胞在组织工程中的应用

2.3 EPCs和MSCs的相互作用

2.4 羊膜机制支架材料的研究现状

第三章 犬骨髓EPCs和MSCs的荧光标记

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 标记细胞的共培养与组织工程化羊膜贴片的构建

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

结论

参考文献

致谢

作者简介