牛SIX1基因转录调控机制及其对骨骼肌细胞增殖、分化的作用研究

摘要

肌肉的基本组成单位是肌纤维，肌纤维的类型、理化性质在一定程度直接影响着肉品质。因此，深入了解肌肉的生长发育机理，阐明肌纤类型的形成与转换机制将有助于揭示肌肉品质决定的分子机制。目前，调控肌肉生长发育相关基因被作为影响肉品质的重要因素来研究。根据前期全基因组关联分析（Genome Wide Association Studies，GWAS）秦川牛生长性状试验结果，筛选出了一些与生长性状相关联的候选基因，鉴定得到Sine oculis homeobox homolog 1（SIX1）基因与秦川牛生长性状显著相关。SIX1基因中在动物肌肉形成及发育过程中扮演着重要角色，对动物骨骼肌的调控贯穿胚胎期到出生后整个过程。但目前关于牛SIX1基因的表达模式，基因功能及转录调控机制尚未报道。 因此，本研究以SIX1基因为影响秦川牛生长肉质性状及骨骼肌发育重要候选基因，分析了该基因的表达模式，并关联分析SIX1基因多态性与秦川牛生长性状的关系。通过生物信息学方法分析，结合定点突变，siRNA （small interfering RNA）干扰，体外甲基化酶修饰，凝胶电泳迁移EMAS（electrophoretic mobility shift assays）以及染色质免疫共沉淀ChIP（chromatin immunoprecipitation assay）技术，研究了牛SIX1基因转录调控机制以及DNA甲基化机制。同时本研究包装了腺病毒介导SIX1基因过表达和干扰病毒，从分子和细胞水平研究了牛SIX1基因对骨骼肌细胞增殖和分化的作用。本研究所取得的结果为揭示牛肌肉生长发育及肉品质形成的分子机理提供了更多的理论依据。所取得的主要结果如下： 1. SIX1基因在牛不同组织中的表达模式及在背最长肌不同发育阶段的表达模式。 （1）采用Real-time PCR及Western blotting方法分析了SIX1基因在牛不同组织的表达模式。结果显示，SIX1基因在背最长肌、腰大肌和比目鱼肌组织中高丰度表达；在瘤胃、睾丸和皱胃的中度表达；在大肠、胃、网胃、皮下脂肪、小肠、肾、脾、肝、心组织中低丰度表达。SIX1基因在1，3，6和12月龄背最长肌表达量显著高于其他各阶段，然而，18月龄后的表达水平明显降低并趋于稳定表达量。在牛肌肉细胞分化阶段， SIX1基因在未分化的肌细胞中表达量显著高于分化水平。对牛SIX1蛋白进行了亚细胞定位显示其在细胞核和细胞质中均有表达。 2. 牛SIX1基因多态性与秦川牛与生长性状的关联分析。 （1）SNP位点扫描SIX1基因的2个外显子和1个内含子，在428头秦川牛个体并未有SNP。采用5’末端RACE技术确定了牛SIX1基因转录起始位点，并扩增了牛SIX1 基因启动子区1.8 Kb的序列，启动子区发现了9个SNP位点g.-1633 G>A (SNP 9);-1357G>T (SNP 8);-867 G>A (SNP 7);-742 T>C (SNP 6);-421 C>T (SNP 5);-409 T>C (SNP 4);-85 G>T (SNP1);g.-63 G>A (SNP2);g.-14 A>G (SNP 3)。 （2）为确定主效应SNPs，借助启动子逐段缺荧光素活性分析，发现仅有SNP1和SNP2落于SIX1基因核心启动子-216～-28 bp。在428头秦川牛个体中，SNP1和SNP2带来4个单倍型（Hap1～4），6个组合单倍型（H1-H1、H1-H2、H1-H3、H1-H4、H3-H3、H3-H4），关联分析两个SNP带来的组合单倍型与秦川牛生长性状，发现H1-H2组合单倍型在体长（BL）、胸深（CD）、胸围（CC）、背膘厚（BF），眼肌面积（ULA）和肌内脂肪含量（IFC）显著的高于其他组合单倍型（P ＜ 0.05）。 （3）通过细胞水平检测了Hap1、Hap2、Hap3、Hap4单倍型酶活，发现Hap2和Hap4单倍型酶活极显著的高于Hap1和Hap3。两两单倍型配对比较发现仅当SNP2号位点（g.-63 G>A）发生时，单倍型酶活差异显著。借助EMSA和ChIP验证了SNP2位点突变带来的新转录因子NRF1和ZSCAN10结合在SIX1基因启动子区，影响了秦川牛优势生长性状的形成。 3. SIX1基因启动子特征及转录调控的研究 （1）克隆获得牛SIX1基因5’上游2000 bp序列。生物信息学预测发现，SIX1基因启动子并不存在典型的真核启动子元件TATA box和CAAT box元件，而MyoD、CREB、PAX7转录因子结合位点及MEF3元件分别在-1831/-1300，-1300/-689和-689/-40重复出现。通过构建启动子这三个片段的荧光素酶载体并在细胞水平酶活测定，结果发现仅当-689/-40片段缺失后酶活下降显著。 （2）通过定点突变，siRNA干扰转录因子MyoD、CREB、PAX7和MyoG，结果发现突变或者干扰MyoD和PAX7后，SIX1基因启动子活性显著上升（P＜0.05），而突变或者干扰CREB和MyoG后，SIX1基因启动子活性显著下降（P<0.01）。进一步利用EMSA和ChIP验证了MyoD、CREB、PAX7和MyoG转录因子能够结合在牛SIX1基因-689/-40启动子区并调控SIX1基因转录活性。 4. SIX1基因启动甲基化水平及甲基化调控分析。 （1）牛SIX1基因核心启动子区（-216/-28）有9个甲基化位点。DNA甲基化水平在胎牛背最长肌和未分化的牛肌肉细胞中甲基化水平显著（P<0.01）的低于成年牛背最长肌和分化的牛肌肉细胞组。生物信息学分析其序列特征，发现组蛋白H4（Histone H4）和E2F2转录因子结合位点。通过构建双荧光素酶活报告载体，结合定点突变，siRNA干扰，pcDNA3.1过表达载体构建，体外甲基化酶修饰，EMSA和ChIP等技术，验证了Histone H4和E2F2结合在SIX1基因核心启动子，分别调控SIX1基因的转录活性和甲基化作用。 5. SIX1基因过表达和干扰腺载体的构建及其基因功能研究 （1）构建了牛SIX1基因的腺病毒过表达载体，并筛选了一条干扰效率为72.13%的牛shRNA-SIX1 ，在HEK 293A细胞系中稳定扩繁到高滴度过表达和干扰腺病毒Ad-SIX1和Ad-shRNA-SIX1。利用酶消化法，差速贴壁法培养获得牛骨骼肌细胞。Real-time PCR检测病毒的有效性。结果表明，在牛骨骼肌细胞中，Ad–SIX1处理组比Ad-CMV-NC对照组的SIX1 mRNA表达量提高了122.5倍（P<0.01），而Ad-shRNA-SIX1处理组比Ad-shRNA-NC对照组的SIX1mRNA表达量降低了65.4%（P<0.01）。 （2）过表达SIX1基因，促进牛骨骼肌细胞分化为肌管，抑制了牛骨骼肌细胞增殖。相反，干扰SIX1基因，抑制牛骨骼肌细胞分化为肌管，促进了牛骨骼肌细胞增殖，且过表达SIX1基因促进牛骨骼肌细胞的迁移。过表达和干扰SIX1基因后一些特异性的快肌基因Tnnt3、Tnnc2、Atp2a1、SRL、MyoG、Mylpf的表达量随着SIX1基因的升高而显著上升（P＜0.05），而干扰SIX1基因后Tnnt3、Tnnc2、Atp2a1、MyoG、Tnnt1、Myl4的表达量也随之下降（P＜0.05)。经线性正相关分析，筛选出SIX1基因的下游调控基因Tnnt3、Tnnc2、Atp2a1、MyoG。 综上所述，本研究在细胞、个体和群体水平上鉴定了与肌肉生长发育相关的功能基因，研究MyoD、CREB、PAX7和MyoG转录因子对SIX1基因在转录调控作用。并从表观遗传调控水平鉴定了Histone H4和E2F2调控SIX1基因在肌肉生长发育分子机制。筛选出了一些与SIX1基因相互调控的特异性的快肌基因。本研究为秦川牛肉用选育改良和高效生产提供科学理论依据。

目录

第一章 文献综述

1.1研究背景

1.2我国黄牛分布及现状

1.3动物育种方法的进展

1.4骨骼肌的组成

1.5骨骼肌的肌纤维类型、结构及特征

1.6骨骼肌发育的分子基础

1.7 SIX1基因的研究进展

1.8本研究目的和意义

第二章 牛SIX1基因CDS区克隆鉴定、表达模式分析

2.1材料与方法

2.2实验结果

2.3讨论

2.4小结

第三章 SIX1基因多态性及牛生长性状的关联分析

3.1 试验材料方法

3.2实验方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5小结

第四章 NRF1和ZSCAN10影响秦川肉牛优势生长性状的形成

4.1材料

4.2. 方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章 MyoD、PAX7、CREB和MyoG对牛SIX1基因转录调控作用

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4讨论

5.5小结

第六章 Histone H4和E2F2对牛SIX1启动子区CpG岛甲基化的转录调控

6.1 材料

6.2 方法

6.3实验结果

6.4讨论

6.5小结

第七章 牛SIX1基因重组过表达和干扰腺病毒包装

7.1 材料

7.2 方法

7.3 结果

7.4 讨论

7.5小结

第八章 过表达和干扰SIX1基因对牛肌肉细胞增殖和分化的影响

8.1 材料

8.2 方法

8.3结果

8.4讨论

8.5小结

第九章 结论

9.1实验结论

9.2创新点

9.3展望

参考文献

附录

致谢

作者简介