稻曲病菌NRPS2与NRPS6基因的功能研究

摘要

水稻稻曲病(rice false smut)是危害水稻晚期穗部的一种真菌性病害。自1878年发现以来，已在世界范围内蔓延，其中亚洲稻区发病最为严重，欧洲、美洲和非洲等 40 个国家的稻区也广泛发生。随着籼粳杂交培育的高产水稻品种的大面积推广，种植密度过大、孕穗期大量追施氮肥及全球性气候变化等因素导致稻曲病发病日趋严重，呈现出发病范围更广、频率更高、减产更重的特点，已由危害水稻的次要病害上升为主要病害。该病由子囊菌纲麦角菌科绿核菌属稻曲病菌［Ustilaginoidea virens（Cooke) Tak］引起。稻曲病发病后，不仅使水稻严重减产，影响水稻品质，而且病原菌产生的毒素Ustiloxins能引起人畜中毒，严重威胁人畜健康。 NRPS 是一类由多个结构域组成的不依赖核糖体和 RNA 模板的肽合成酶, 各个结构域协同作用催化合成许多重要的肽类次级代谢产物。其中NRPS2与NRPS6已在禾谷镰刀菌中被证实与铁菌素合成和铁代谢相关。铁是植物、微生物生长所必须的微量元素，铁载体能够从环境中吸收不可直接利用的铁离子，转运到体内转化为能被吸收的铁离子并释放，是植物和微生物获得铁元素的重要方式。 开展稻曲病菌致病机理研究可为稻曲病防控提供科学依据。但由于稻曲病菌自身特点，遗传转化非常困难，严重阻碍了其分子机理研究的进程。 近几年CRISPR-Cas9基因编辑技术以其易于操作，效率更高等特点迅速成为生命科学领域最炙手可热的研究工具，推进了实验生物学的快速发展。本论文使用CRISPR-Cas9方法成功获得了稻曲菌NRPS2和NRPS6基因的缺失突变体。研究结果表明，稻曲菌UvNRPS2与UvNRPS6缺失突变体对氧化胁迫以及其他胁迫（如NaCl、Sorbitol、SDS、Congo Red）的耐受力均减弱，UvNRPS2与UvNRPS6缺失导致菌株在YTD等培养基上的生长减慢，同时分生孢子的形成和萌发受到抑制，部分分生孢子形态发生变异，对水稻根芽萌发的抑制作用减弱，据此推测稻曲菌中缺失NRPS2与NRPS6基因导致致病力降低。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1水稻稻曲病概况

1.1.1水稻稻曲菌的形态及分类

1.1.2水稻稻曲菌的侵染循环

1.1.3稻曲病的流行病学特征

1.1.4稻曲病的危害

1.1.5稻曲病的防治

1.2 NRPS基因簇相关概述

1.3 CRISPR的研究概况

1.3.1 CRISPR-Cas系统的历史和生物学

1.3.2 CRISPR-Cas9介导的基因组靶定机制

1.4本研究的依据、目的意义及技术路线

1.4.1本研究的依据

1.4.2本研究的目的及意义

1.4.3技术路线

第二章稻曲病菌UvNRPS2、UvNRPS6基因的敲除

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2 实验方法

2.2实验结果

2.2.1 UvNRPS2及UvNRPS6进化树构建

2.2.2 UvNRPS2及UvNRPS6的PCR及Southern验证结果

2.3小结

第三章基因缺失突变体的功能验证

3.1材料与实验方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2实验结果

3.2.1菌落形态及菌落的生长速率

3.2.2分生孢子量及孢子形态

3.2.3分生孢子萌发

3.2.4菌株对不同胁迫的耐受力

3.2.5菌株对水稻种子萌发的影响

3.2.6水稻接种实验

3.2.7 GC-MS分析次生代谢产物

3.3 小结

3.4 讨论

第四章 总结

参考文献

致谢

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