宿主细胞FHC与CSFVNS4B互作及对CSFV增殖的影响

摘要

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的猪瘟（Classical swine fever， CSF）广泛分布于很多国家和地区，曾给全世界养猪业造成了巨大的经济损失，世界动物卫生组织（OIE）将其规定为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。虽然猪瘟在少数发达国家和地区已被成功净化，但是猪瘟在全世界很多养猪国家和地区仍时有发生，我国采取疫苗接种与病猪扑杀相结合的防控措施，虽然取得了一定的效果，但猪瘟仍时有发生，以非典型、温和型猪瘟和持续带毒为主，严重制约着我国养猪业的健康发展。因此，我国仍需要探索出能够有效防控猪瘟病毒感染与传播的新方法和新途径。由于病毒有限的基因组，其在宿主细胞内的有效增殖及感染又必须利用宿主细胞内成分。因此，探究宿主细胞内成分对猪瘟病毒增殖的影响及作用机制具有重要科学意义。 细胞凋亡是宿主抵抗病毒感染、抑制病毒增殖的重要途径。因此，很多病毒进化出了一套能够抑制或延迟宿主细胞凋亡的有效策略，从而实现有效的持续性感染。现有的研究表明猪瘟病毒感染体外培养的细胞不能引起细胞凋亡。重链铁蛋白（ferritin heavy chain，FHC）是一个公认的抗凋亡蛋白，但有关FHC在猪瘟病毒感染过程中的作用还未见报道。本文研究了宿主细胞FHC与CSFV NS4B互作及对猪瘟病毒增殖的影响，获得了以下结果： （1)细胞内FHC与CSFV NS4B之间存在相互作用。通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）和GST pull-down（glutathione S-transferase (GST) pull-down）证明FHC与CSFV NS4B蛋白可以发生相互作用；通过激光共聚焦证实了FHC和CSFV NS4B在PK-15细胞内存在共定位现象。 （2）细胞内FHC促进CSFV的增殖。成功构建了慢病毒感染介导的FHC稳定过表达与稳定低表达的PK-15细胞系，并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitive PCR，RT-qPCR）、Western blot以及间接免疫荧光试验检测发现，FHC过表达会促进CSF V增殖，而FHC的稳定低表达会抑制CSFV增殖；NS4B蛋白的表达以及CSFV的感染都能够上调细胞内FHC的表达水平。 （3）FHC在CSFV感染过程中起着抗凋亡作用。流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，结果显示，FHC能够通过稳定细胞内RO S水平而抑制细胞凋亡，在CSFV感染过程中起着抗凋亡作用。 以上研究结果表明，FHC是CSFV NS4B的一个互作蛋白，在CSFV增殖过程中起着正向的促进作用，并通过稳定细胞内ROS水平而抑制细胞凋亡。

目录

声明

第一章 猪瘟病毒和重链铁蛋白研究进展

1. 1 猪瘟病毒研究进展

1.2 CSFV基因组及其编码蛋白在病毒感染及增殖过程中的作用

1.2.1 CSFV囊膜蛋白介导病毒粒子的吸附和入侵

1.2.2 CSFV基因组非编码区以及非结构蛋白对CSFV增殖的调控

1.2.3 宿主细胞内成分调控CSFV的增殖

1.2.4 CSFV逃逸宿主天然免疫

1.2.5 宿主细胞内成分对病毒毒力的影响

1.2.6 CSFV感染对宿主细胞凋亡和细胞周期的影响

1.3 重链铁蛋白（FHC）研究进展

1.3.1 真核生物体内铁蛋白的结构

1.3.2 真核生物铁蛋白的化学性质

1.3.3 真核生物体内铁蛋白的平衡以及降解

1.3.4 哺乳动物体内对铁蛋白表达的调控

1.3.5 哺乳动物体内铁蛋白的功能

第二章 FHC与CSFV NS4B蛋白相互作用的研究

2. 1 材料

2.1.1 菌株、病毒、细胞和质粒

2.1.2 主要试剂、试剂盒与抗体

2.1.3 仪器设备

2. 2 方法

2.2.1 载体构建

2.2.2 原核重组质粒的表达结果验证

2.2.3 真核重组质粒的转染与表达结果验证

2.2.4 免疫共沉淀验证FHC与NS4B的相互作用

2.2.5 GST pull-down验证FHC与NS4B的相互作用

2.2.6 激光共聚焦验证FHC与NS4B的相互作用

2. 3 结果

2.3.1 载体鉴定

2.3.2 原核重组质粒表达结果鉴定

2.3.3 真核重组质粒表达结果验证

2.3.4 Co-IP验证FHC与NS4B的相互作用

2.3.5 GST pull-down验证FHC与NS4B的相互作用

2.3.6 激光共聚焦验证FHC与NS4B的相互作用

2. 4 讨论

2. 5 小结

第三章 FHC对猪瘟病毒增殖的影响

3. 1 材料

3.1.3 仪器设备

3. 2 方法

3.2.1 FHC过表达与shRNA慢病毒干扰载体的构建

3.2.2 重组慢病毒包装及其滴度测定

3.2.3 FHC过表达细胞系与FHC稳定低表达细胞系的建立

3.2.4 MTT试验检测慢病毒介导FHC过表达以及稳定低表达对细胞活力的影响

3.2.5 实时荧光定量RCR检测FHC的mRNA水平

3.2.6 Western blot检测FHC的蛋白表达水平

3.2.7 FHC过表达以及FHC稳定低表达对CSFV增殖的影响

3.2.8 外源NS4B蛋白表达以及CSFV感染对FHC表达水平的影响

3.2.9 FHC在CSFV感染过程中对细胞凋亡水平的影响

3.2.10 FHC在CSFV感染过程中对细胞内ROS水平的影响

3.2.11 数据统计分析

3. 3 结果

3.3.3 FHC稳定过表达以及FHC稳定低表达细胞系的建立

3.3.4 MTT法检测慢病毒介导FHC过表达以及稳定低表达对细胞活力的影响

3.3.5 FHC稳定过表达细胞系以及FHC稳定低表达细胞系FHC表达水平鉴定

3.3.6 FHC过表达对CSFV增殖的影响

3.3.7 FHC稳定低表达对CSFV增殖的影响

3.3.8 外源NS4B蛋白表达以及CSFV感染对FHC表达水平的影响

3.3.9 FHC在CSFV感染过程中对细胞凋亡水平的影响

3.3.10 FHC在CSFV感染过程中对细胞内ROS水平的影响

3. 4 讨论

3. 5 小结

结论

参考文献

致谢

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