褪黑素对脂肪细胞内质网应激诱导炎症的影响及其分子机制研究

摘要

褪黑素作为多功能生物因子，具有多样的调节作用，包括抗氧化、抗炎以及参与免疫调节等，但是关于褪黑素是否通过影响内质网应激对炎症起作用却未知。本试验通过使用衣霉素处理建立 3T3-L1 脂肪细胞内质网应激模型诱导炎症，再用褪黑素，分别检测了其对内质网应激与炎症不同方面的影响以及作用机制，共获以下结果： 1．褪黑素通过上调生物节律从而缓解内质网应激。 使用1μmol/L褪黑素（Melatonin, MT）处理成熟的脂肪细胞24h之后，检测发现生物钟基因CLOCK和BMAL1的mRNA表达显著增加（P＜0.05）、PER1、PER2、CRY1、CRY2和REV-ERB的mRNA表达显著减少（P＜0.05），内质网应激和炎症相关基因表达也发生了显著的下降；用钙离子探针对脂肪细胞染色后发现，褪黑素处理显著减少钙离子荧光强度从而缓解内质网应激；通过检测PER1在MT处理前后的DNA甲基化水平显示，褪黑素通过下调生物钟基因PER1的DNA甲基化促进生物节律，其中甲基化结合蛋白3(Methyl-CpG-binding domain 3,MBD3)的减少最显著；进一步在细胞中干扰PER1后发现内质网应激关键通路分子ATF6的mRNA水平显著增加（P＜0.05），使用生物信息学预测发现ATF6启动子区有两个位点可以与PER1的E-box位点相结合，通过荧光素酶活性检测发现干扰PER1基因可以显著增加两个E-box位点的相对荧光活性（P＜0.05），说明PER1通过负转录调控ATF6缓解内质网应激。 2．褪黑素减轻内质网应激介导的炎症反应。 为了检测褪黑素对内质网应激介导炎症的现象作用，使用2 ug/mL的衣霉素（tunicamycin, TM）处理细胞12h构建内质网应激的模型，再用褪黑素处理，检测发现内质网应激标志因子ATF6、PERK、IRE1、GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表达水平均显著上调（P＜0.05），炎症相关基因IL-6、TNF-α、NF-κB、NLRP3、IL-1β的mRNA和蛋白表达也显著增加（P＜0.05），说明了内质网应激成功诱导炎症的发生，而MT处理可以缓解这种作用；此外，使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）处理，发现当内质网应激被抑制时，炎症相关基因表达显著下调。又通过活体注射 20 mg/kg 的褪黑素和1μg/g衣霉素，发现内质网应激和炎症相关基因在脂肪组织中的表达发现与细胞水平一致，并且通过对脂肪组织切片进行H&E染色，发现内质网应激条件下，炎性浸润现象明显，且ATF6的免疫组化水平显著增加，IL-6、TNF-α、GRP78和ATF6的免疫荧光强度也显著升高，而MT可以抑制这种作用，以上说明MT可以缓解内质网应激介导的炎症反应。 3. 褪黑素减轻内质网应激诱导M1型巨噬细胞极化介导炎症反应。 脂肪细胞炎症与巨噬细胞之间的作用联系密切，本实验使用脂肪细胞与巨噬细胞共培养，分别使用脂多糖（LPS）和白介素-4（IL-4）诱导M1和M2型巨噬细胞的成熟，脂肪细胞中超表达内质网应激关键通路因子ATF6，通过检测M1型巨噬细胞标志基因IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12以及M2型巨噬细胞标志基因CD163、CD206、IL-10和IL-4的mRNA及蛋白表达，发现脂肪细胞内质网应激条件下 M1 型巨噬细胞表面标志基因表达显著上调，M2型巨噬细胞表面标志基因表达显著下降；对IFN-γ和CD163的免疫荧光染色发现，脂肪细胞内质网应激可以促进IFN-γ的荧光强度，减弱CD163的荧光表达，而在添加了褪黑素之后，这些现象被逆转。此外，发现超表达ATF6后，炎性小体相关基因NLRP3、Pro-caspase1、Caspase1、Pro-IL-1β和IL-1β的mRNA及蛋白水平也发生了显著的上调（P＜0.05），使用MT处理之后，作用相反，说明脂肪细胞内质网应激可以通过激活炎性小体表达促进炎症，而MT可以减轻这种作用。以上结果说明了褪黑素缓解内质网应激介导的炎症反应。 综上所述，本试验明确了褪黑素在脂肪细胞内质网应激和炎症中的调控作用，即褪黑素通过增加生物钟基因节律表达抑制内质网应激诱导的炎症反应，并且发现DNA甲基化、基因转录调控及巨噬细胞极化等机制参与其中。本研究为治疗脂肪细胞炎症反应提供了新的靶点，为研究动物脂肪沉积的遗传调控提供一定的理论基础。

目录

声明

第一章 褪黑素与生物钟基因的研究与应用

1.1褪黑素的研究概况

1.2昼夜节律与生物钟基因

第二章 内质网应激研究进展

2.1 内质网应激研究概况

2.2脂肪细胞炎症概况

2.3 内质网应激与炎症

试验研究

前言

第三章 褪黑素通过调节生物节律对内质网应激的作用机制

3.1材料

3.2方法

3.3结果与分析

3.4 讨论

3.5小结

第四章 褪黑素对内质网应激诱导炎症的影响

4.1材料

4.2方法

4.3结果与分析

4.4 讨论

4.5小结

第五章 褪黑素减轻内质网应激通过巨噬细胞极化诱导炎症的作用机制

5.1材料

5.2方法

5.3结果与分析

5.4 讨论

5.5小结

结论、创新点以及进一步研究内容

1 结论

2 创新点

3 进一步研究内容

参考文献

附录

致谢

作者简介