miR-211通过靶定Meis1调节F9细胞中多能性因子表达

摘要

CHIR99021（简称CHIR）能有效激活J1和F9细胞 Wnt/β-catenin信号通路，并能促进多能性基因Nanog表达。miR-211是 Wnt/β-catenin 信号通路应答的miRNA， CHIR通过激活Wnt/β-catenin 诱导miR-211表达。miR-211在调节细胞多能性方面的报道还比较少，所以本项目主要研究miR-211对F9细胞中多能性因子的调节作用。 首先根据文献，用10μmol的CHIR处理小鼠F9细胞，发现细胞中miR-211表达水平显著上调。接下来在F9细胞中分别转染miR-211 mimic及其NC，miR-211 inhibitor及其NC，qPCR及western检测几个多能性因子的表达变化。结果显示，转染mimic后， Nanog、Klf4及Oct4在mRNA水平变化均不显著，而在蛋白水平表达量都呈上升趋势；转染 inhibitor 后，它们在 mRNA 水平变化也不显著，但在蛋白水平表达量都呈下降趋势。免疫荧光显示，转染mimic后，与对照组相比，Nanog、Klf4及Oct4的荧光亮度都增强。预示着miR-211对F9细胞多能性的维持具有一定作用。 为进一步探究 miR-211 如何发挥功能，首先从它的靶基因入手。通过软件预测miR-211的靶基因并取交集，聚类分析后，选出在与细胞多能性相关通路上的靶基因进行验证。在F9细胞中转染miR-211 mimic，qPCR初步检测所选的四个靶基因，结果显示Meis1的mRNA水平下调最显著。为验证Meis1是否为miR-211靶基因，首先根据预测的miR-211与Meis1结合位点，构建Meis1野生型及突变型报告载体。双荧光素酶报告分析显示，Meis1会受到miR-211的抑制，而突变掉两者结合位点后，其抑制作用会解除，说明两者的结合位点是突变位点。qPCR及western blot结果显示，转染mimic后，Meis1的表达量在mRNA及蛋白水平都显著下调。而转染inhibitor后，Meis1的表达量在mRNA及蛋白水平都有上调趋势。由此可以确定Meis1为miR-211的靶基因。 对靶基因Meis1功能的研究，首先构建了Meis1的表达载体。用CHIR处理F9细胞，当浓度为 10μmol 时 Meis1 在 mRNA 水平显著下调，显示 CHIR 可能是通过促进miR-211表达从而抑制Meis1表达。接下来用qPCR及western的方法检测Meis1对F9细胞中多能性因子的调节作用。结果显示，过表达Meis1 后，Nanog在 mRNA及蛋白水平都呈下调趋势，Klf4和Oct4在mRNA水平下调趋势不显著，两者在蛋白水平都显著下调。干扰 Meis1 后，Nanog和Oct4 在 mRNA和蛋白水平都呈上调趋势。Klf4 在mRNA 水平上调趋势不显著，在蛋白水平显著上调。由此显示 miR-211 对 F9 细胞中Nanog、Klf4及Oct4的调节作用可能是通过靶向Meis1来完成的。 本项目主要探究了 CHIR 处理 F9 细胞后，促进细胞中 miR-211 的表达，miR-211 通过靶向Meis1来调节细胞中Nanog、Klf4及Oct4的表达。由此说明miR-211对F9细胞多能性的维持具有一定的作用。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 miRNA

1.2 Meis1

1.3 Wnt信号通路与CHIR简介

1.4 研究目的和意义

第二章 CHIR对F9细胞miR-211表达的调控

2.1 试验材料与试剂

2.2 试验方法

2.3 试验结果

2.4 讨论

第三章 miR-211对F9细胞中多能性因子的调节作用

3.1试验材料与试剂

3.2 试验方法

3.3试验结果

3.4 讨论

第四章 miR-211靶基因的预测及验证

4.1试验材料与试剂

4.2 试验方法

4.3 试验结果

4.4 讨论

第五章 靶基因功能的探究

5.1试验材料与试剂

5.2 试验方法

5.3试验结果

5.4 讨论

结论

参考文献

致谢

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