紫心大白菜花青素合成和积累的分子机理研究

摘要

花青素是一类广泛存在于植物的叶、花朵、果实等器官的水溶性色素，它不但赋予植物这些器官以斑斓的颜色和风味，它还帮助一些植物吸引昆虫从而完成授粉，同时在抵抗生物或者非生物胁迫中起到重要作用。更重要的是，大量研究表明花青素由于拥有较强的抗氧化能力，从而可以预防癌症、心血管等疾病。因此，富含花青素的食品越来越受到广大消费者的青睐以及市场的欢迎。 大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour) Olsson]作为中国的本土蔬菜，是我国栽培面积和消费产量最大的蔬菜作物。由于自然界未发现紫色大白菜资源，而富含花青素的大白菜又具有重要的营养价值和保健功能。因此，研究紫色大白菜花青素积累机理的需求十分迫切，该研究不仅可以丰富植物花青素代谢知识，而且将为紫心大白菜的改良提供理论基础和技术支持。 本研究以西北农林科技大学大白菜课题组多年选育的紫心叶球大白菜纯系为试材，以其育种过程中的原始母本白色叶球大白菜和提供紫色遗传背景的紫菜薹原始父本为参照。通过研究紫心大白菜的叶球中不同叶位的花青素合成基因的表达和花青素的积累特性，鉴定、克隆了控制紫心大白菜紫心叶球性状的关键基因。发现该基因的序列结构以及其育种的原始亲本该基因的序列的差异，根据不同材料该基因序列之间的差异开发出功能标记，并在紫心大白菜和白球大白菜杂交所得的F2群体进行验证分析。通过过表达转化野生型拟南芥验证了该基因的功能，并进一步研究了转基因拟南芥纯系材料中花青素合成相关代谢途径的差异变化，明确了紫心大白菜紫色叶球花青素积累的分子机理。该研究不仅丰富了十字花科芸薹属植物花青素代谢的调控理论，还为大白菜的球色遗传改良提供理论依据和技术支撑。论文取得了如下主要结果： 1. 紫心大白菜花青素在上表皮中主要积累于紫色球叶表皮下的三层叶肉细胞，而下表皮的花青素主要积累在表皮细胞下的两层细胞，其花青素积累层数的较紫菜薹供体亲本的花青素积累层分别增加了一层。但花薹和幼嫩果荚中花青素的积累层和紫菜薹中的位置和数目一致。紫心大白菜叶球的花青素含量呈现从叶球最内叶到最外叶递减的趋势，较普通大白菜有显著的抗氧化性。紫心大白菜的不同叶位组织的抗氧化能力和其花青素的含量高度相关，和类胡萝卜素、总叶绿素的含量的相关性不显著。 2. 紫心大白菜的花青素在低于45 ℃温度，pH≤3的条件下有较高的稳定性。随着pH增加，花青素的吸收峰出现红移；当温度和pH均升高时吸收峰红移后甚至消失。紫心大白菜中的花青素主成分以高度酰基化和糖基化修饰的矢车菊色素为主。 3. 通过紫心大白菜的叶球中不同叶位的花青素相关基因的差异表达和花青素的积累特性分析，筛选克隆了一个控制紫心大白菜紫心叶球性状的关键调节基因BrMYB2，该基因位于本实验室用图位克隆法确定的紫心性状的候选区间内，实现了图位克隆与同源克隆的结合。 4. 对紫心叶球大白菜及其双亲BrMYB2基因的序列比对发现：三种材料的启动子序列差异不大，仅在一个CT重复的微卫星序列有个别碱基数量差异；基因序列上，紫心大白菜该基因的基因组DNA和编码区序列与紫菜薹亲本完全一致，但与白色叶球白菜有较大的差异。紫色材料和白色材料在该基因的基因组DNA序列中，紫色材料较白色材料在该基因的第一个内含子存在一个约3773bp的大片段的缺失和个别碱基差异；在该基因的编码区序列存在2个点突变，可导致2个氨基酸的差异。 5. 根据紫心大白菜和白色大白菜BrMYB2第一个内含子区域的大片段差异开发了大白菜紫心叶球的功能标记Marker1和Marker2，该功能标记在种苗期就可以准确区分紫心和白色叶球材料，一方面可用于紫色叶球大白菜辅助选择，另一方面从遗传学角度证明BrMYB2就是控制大白菜紫心性状的关键基因。BrMYB2除了在叶球组织表达外，在紫心大白菜幼嫩的靠近生长点的花蕾和花薹、花薹叶表达量比较高。 6. BrMYB2启动子序列的遗传转化功能分析表明CT重复序列的数量不影响下游基因的表达水平，该CT-rich结构的缺失仍然可以导致下游基因高表达，间接说明BrMYB2的差异表达并不是由于启动子序列的差异所导致。 7. 对野生型的拟南芥进行BrMYB2的CDS遗传转化，结果表明：过表达紫心大白菜BrMYB2的cDNA全长（35S-BrMYB2）和包含2个SNP的普通大白菜BrMYB2的cDNA全长（35S-Brmyb2）的拟南芥均出现一致的紫色表型，而且该基因和花青素合成相关基因的表达水平也相似。这些结果说明基因编码区2个SNP并不可以导致该基因功能的丧失，紫心大白菜BrMYB2的cDNA和普通大白菜Brmyb2的cDNA功能相同，其叶球颜色差异不是基因SNP差异产生的结果。 8. 对野生型的拟南芥进行BrMYB2的gDNA遗传转化，结果表明：过表达紫心大白菜BrMYB2的gDNA全长（35S-gBrmyb2，第一个内含子缺失3773bp）的转基因拟南芥出现红色表型，颜色甚至深于仅转化CDS序列的株系（35S-cBrMYB2）；转化第一内含子包含一个大片段插入的普通大白菜BrMYB2的gDNA全长（35S-Brmyb2）的拟南芥没有出现红色表型，该株系和野生型拟南芥表型完全一致。这些结果说明紫心大白菜BrMYB2基因中第一内含子区域上的缺失突变促进了BrMYB2基因的表达，白色叶球大白菜BrMYB2基因中第一内含子中的大片段插入是导致该基因极低的表达，从而使普通大白菜不积累花青素的关键原因。

目录

第一章 文献综述

1.1植物花青素研究进展

1.2 花青素的生化合成研究

1.3 花青素合成的转录调控研究

1.4 十字花科作物关于花青素的研究进展

1.5 本研究的目的意义和技术路线

第二章 紫心大白菜花青素的积累特性、抗氧化能力和稳定性评定

2.1紫心大白菜花青素的组织学分布特性

2.2 紫心大白菜花青素的积累特性和总抗氧化能力评定

2.3 紫心大白菜花青素的成分与含量分析

2.4 紫心大白菜花青素在不同温度和pH条件下的稳定性研究

第三章 紫心大白菜花青素合成相关基因的表达分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论与结论

第四章 紫心大白菜花青素积累关键基因BrMYB2的克隆分析及功能标记的开发

4.1紫心大白菜花青素积累关键基因BrMYB2的克隆和表达分析

4.2 BrMYB2基因功能标记的开发和分离群体的遗传学验证

第五章 紫心大白菜花青素积累关键基因BrMYB2启动子的序列分析和功能研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论与结论

第六章 紫心大白菜花青素积累关键基因BrMYB2在拟南芥中的功能分析

6.1 紫心大白菜花青素积累关键基因BrMYB2的CDS在拟南芥中的功能分析

6.2 紫心大白菜花青素积累关键基因BrMYB2的gDNA在拟南芥中的功能分析

第七章 结论、创新点与展望

7.1 结论

7.2 创新点

7.3 展望

参考文献

附录

附录1 植物基因组总RNA的提取

附录2 利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA一链

附录3 改良CTAB法提取大白菜基因组DNA

附录4 琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，中国）回收目标片段的具体操作步骤

附录5 大肠杆菌感受态细胞的遗传转化和阳性克隆的鉴定

附录6 利用天根的Plasmid Mini Kit提取质粒DNA的步骤

附录7 农杆菌GV3101感受态细胞的制备

附录8 农杆菌GV3101感受态细胞的遗传转化和阳性克隆的鉴定

附录9 农杆菌介导法转化拟南芥和阳性苗的筛选

附录10 不同材料的BrMYB2基因的gDNA序列比对

附录11 普通大白菜94S17和Chifu的BrMYB2基因的gDNA序列比对

附录12 大白菜中有关花青素合成相关基因的qRT-PCR引物表

附录13 大白菜中有关BrMYB2基因的启动子克隆和载体构建的引物

附录14 转基因拟南芥中有关有关花青素合成相关基因的qRT-PCR引物表

缩略词

致谢

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