豌豆蚜孤雌生殖期RNAi效率比较及有性生殖期的产卵规律研究

摘要

蚜虫是一类属于半翅目的小型昆虫，其通过刺吸式口器直接取食植物汁液并传播各种植物病毒对作物生产造成损失，是主要的农业害虫之一。豌豆蚜具有蚜虫类的许多典型特征，如翅型和体色分化、孤雌生殖和有性生殖等多型现象；豌豆蚜的全基因组序列已经公布，许多个转录组数据也已经公布，是开展蚜虫分子生物学研究的理想对象。 RNAi作为一种研究基因功能的重要技术，在昆虫中已得到了广泛的应用。但在目前的研究表明RNAi效率在不同昆虫中变化很大，多种主要类群昆虫之中RNAi效率相对较低，严重阻碍了此项技术的广泛应用。在豌豆蚜中已利用RNAi研究了多个基因的功能，然而不同研究结果之间RNAi效率差异很大，有些结果甚至存在冲突，考虑到蚜虫在自然存在的种群多样以及多型情况，还不清楚蚜虫RNAi效率的变化是否与其不同多型存在关联。为了阐明这一问题，首先选择了在果蝇等多种昆虫之中被普遍用作表型标记的yellow和white基因，利用注射法RNAi技术在豌豆蚜不同多型组合之中（绿色有翅/无翅型、红色有翅/无翅型）的效率差异进行了比较。研究发现，靶标基因的dsRNA仅在绿色型无翅蚜之中诱导了靶标基因表达水平的降低，且在导入48小时后目标基因的表达水平即恢复正常，而在其它多型组合的蚜虫之中相关基因的表达并未受到影响；同时还检测了注射上述基因的dsRNA后虫体内相关RNAi作用通路之中关键分子（Sid-1、Ago-2、R2D2、DcR-1）的表达情况，仅Sid-1和Ago-2基因的表达水平被上调，其它基因的表达并未有显著的变化。这些结果表明，RNAi效率在不同多型豌豆蚜之中存在差异，但是与体色和翅型组合的多型之间并无显著的相关性，且RNAi通路分子之中仅有部分基因的表达与目标基因抑制相关。综合不同多型中这两个基因的RNAi效率，可以发现RNAi效率在豌豆蚜各多型之中普遍较低，这提示存在于血淋巴之中的一些核酸酶可能参与了细胞外dsRNA的降解。以绿色型豌豆蚜为对象，又进一步研究了不同翅型中血淋巴在体外对不同基因dsRNA的降解能力，研究发现dsRNA的降解效率与血淋巴之中相关酶的含量密切相关，高浓度的血淋巴提取液均能快速的降解dsRNA，无翅蚜与有翅蚜相比，其血淋巴降解dsRNA的速率稍慢一些。 上述实验结果说明，在豌豆蚜中RNAi效率较低是一种在各多型之中普遍存在的客观现象，血淋巴之中的相关核酸酶类可能是影响RNAi效率的关键。因此，通过转录组分析比较导入dsRNA不同时间之后相关基因的表达情况，并结合豌豆蚜全基因组筛选的方法，试图找到可能影响豌豆蚜RNAi效率的相关核酸酶。然而转录组分析结果并未发现任何相关核酸酶的基因，但是通过全基因组筛选的方法找到了5个潜在的核酸酶基因，并通过RT-PCR方法在血淋巴中初步确定了两个潜在的核酸酶基因的表达，其具体功能有待于进一步深入的研究。 上述两项研究表明，RNAi效率虽然在不同多型豌豆蚜之中存在一定的差异，但整体而言RNAi效率均相对较低，这极大地阻碍了利用此项技术对豌豆蚜相关基因功能的研究，基于DNA编辑的CRISPR/Cas9技术为提供了新的契机。目前在多种昆虫之中已经应用CRISPR/Cas9技术进行了成功的基因编辑，已有的实验表明昆虫CRISPR/Cas9成功的关键点之一是要将sgRNA和Cas9蛋白在囊胚期之前注射入卵内。而实验室的豌豆蚜种群一般都是孤雌生殖，因此要开展蚜虫的基因编辑实验，首先需要诱导孤雌蚜产生有性蚜，有性蚜交配后产卵，而蚜虫卵一般必须要经过3个月左右时间才能孵化出来干母蚜，因此明确豌豆蚜产卵规律是开展CRISPR/Cas9实验的关键之一。对孤雌蚜分别进行不同的低温短光照处理，在第三代诱导得到雄蚜和性雌蚜，不同性比（1雌1雄和2雌1雄）交配后，发现从产第一粒卵开始，1雌1雄比例每日单雌产卵数均高于2雌1雄比例单雌产卵数，但单雌每日产卵量均较低。因此，获得足够的雄蚜和性雌蚜是收集大量早期胚胎的关键。另外，1雌1雄交配后每天日间的产卵数要高于夜间，而2雌1雄交配后每日昼夜产卵出无差异。然后，检测了4℃滞育不同时期后的卵孵化率，结果表明，卵在4℃分别滞育90天、100天和110天后孵化率分别为52.3%，49.2%和57.6%，孵化率间无显著差异，考虑到实验周期和卵在滞育时的消耗，低温滞育90天可作为CRISPR实验应用时卵滞育的时间。 综上所述，不同多型间的豌豆蚜RNAi效率的确存在差异，但普遍表现出RNAi效率较低的特性。血淋巴之中存在的能够快速降解dsRNA的核酸酶可能是影响豌豆蚜RNAi效率的关键之一，对相关酶类基因功能的进一步研究将有助于阐明这一问题。采用CRISPR/Cas9技术为研究蚜虫基因功能的关键之一是要获取囊胚期的卵，豌豆蚜较低的日均产卵量表明获取充足的雌性蚜和雄性蚜是获得充足卵的关键。本研究为准确评估RNAi技术在蚜虫基因功能研究和促进新型CRISPR/Cas9技术在蚜虫功能基因解析方面的应用奠定了重要基础。

目录

主要符号对照表

第一章文献综述

1.1 蚜虫及豌豆蚜

1.1.1 蚜虫的多型现象

1.1.2 蚜虫的生活史

1.1.3 豌豆蚜

1.2.1 RNAi的发现史

1.2.1 RNAi的作用机制

1.2.2 RNAi在昆虫中的应用

1.2.3 RNAi在昆虫研究之中遇到的问题

1.3.1 CRISPR/Cas9的作用机制

1.3.2 CRISPR/Cas9在昆虫中的应用

1.3.3 CRISPR/Cas9技术在昆虫应用的关键点

1.4 研究的目的意义和内容

第二章孤雌生殖期豌豆蚜不同多型间RNAi效率的比较研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 供试昆虫与植物

2.2.2 酶和主要试剂

2.2.3 常用溶液和培养基

2.2.4 主要仪器

2.2.5 试验方法

2.2.6 数据分析

2.3.1 靶标基因的时空表达

2.3.2 不同翅型豌豆蚜中RNAi的研究

2.3.3 不同色型豌豆蚜RNAi的效果

2.3.4 不同多型豌豆蚜导入dsRNA后RNAi核心分子的响应

2.3.5 RNAi效率与遗传背景的关系

2.3.6 不同翅型豌豆蚜血淋巴降解核酸能力

2.4 讨论

第三章豌豆蚜血淋巴dsRNA核酸酶基因的初步筛选

3.1 前言

3.2.1 供试昆虫与植物

3.2.2 主要试剂和仪器

3.2.3 利用转录组测序技术筛选可能存在的核酸降解酶

3.2.4 NCBI筛选豌豆蚜中可能的核酸酶

3.2.5 Nuclease-like基因的验证

3.3 结果与分析

3.3.1 转录组核酸酶预测

3.3.2 本地核酸酶预测

3.3.3 预选核酸酶基因的电泳检测

3.4 讨论

第四章有性蚜的诱导和产卵规律的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 供试昆虫与植物

4.2.2 主要试剂与仪器

4.2.3 有性蚜诱导

4.2.4 交配及产卵规律

4.2.5 卵的孵育

4.2.6 统计分析

4.3 结果与分析

4.3.1 不同性比交配后产卵规律

4.3.2 滞育不同天后卵的孵化规律

4.4 讨论

第五章全文总结

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 研究展望

参考文献

致谢

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