肠炎沙门氏菌纳米抗体的制备及免疫分析检测方法的建立

摘要

食源性疾病是目前全球最广泛的公共卫生问题之一。在世界各地的食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的食物中毒病例达到前列。因此，建立沙门氏菌的快速检测方法是预防食品安全问题的重要手段。免疫学检测分析法具有快速、灵敏等特点，适用于大批量样本的快速筛查，其中高质量的抗体为该方法的核心元件，抗体的重链可变区（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH）是目前已知的具有完整抗原识别能力的最小的抗体片段，又称为纳米抗体。由于纳米抗体相较于传统抗体具有一些独特的优势，如分子量小，高度的水溶性和稳定性，较高的亲和力，能够识别缝隙间的抗原表位及容易获得和表达，使其在医学诊断、疾病治疗、食品安全等领域得到了广泛的应用。 本研究应用噬菌体展示技术，通过免疫双峰驼，构建了噬菌体展示纳米抗体文库，并通过生物淘选方法，成功筛选获得肠炎沙门氏菌纳米抗体，对其热稳定性与特异性进行了初步鉴定，并建立了双抗体夹心ELISA方法检测肠炎沙门氏菌，为沙门氏菌的检测方法提供了新的思路。本研究取得的主要结果如下： 1.构建了肠炎沙门氏菌噬菌体展示纳米抗体文库，具有良好的多样性。 通过使用灭活的肠炎沙门氏菌对双峰驼进行5次免疫，免疫后采集骆驼外周血，提取总RNA，反转录为cDNA，通过巢式PCR方法扩增编码双峰驼的重链抗体可变区（VHH）的基因片段。将VHH基因与pComb3X载体连接后电转化入E.coli ER2738感受态细胞中，成功构建噬菌体展示纳米抗体文库。经测定，构建的文库库容量约为1.78×107，文库插入效率达到100%；随机挑取23个单菌落测序后进行序列比对，结果显示文库具有良好的多样性。 2.首次研制获得肠炎沙门氏菌纳米抗体，具有良好的特异性与热稳定性。 通过四轮的“淘选-洗脱-扩增”的生物淘选过程，采用phage-ELISA鉴定阳性噬菌体，经测序和序列比对分析后，获得了三种不同序列的纳米抗体，分别命名为Nb13、Nb16和Nb22。将含有这三种纳米抗体VHH基因的质粒转化至E.coli Top10F’感受态细胞中，成功表达三种纳米抗体。对三种纳米抗体的热稳定性和特异性进行鉴定，结果显示得到的三种纳米抗体均具有良好的热稳定性和特异性。 3.建立了基于纳米抗体Nb13的双抗体夹心ELISA免疫检测方法。 建立了基于纳米抗体Nb13的双抗体夹心ELISA检测方法，肠炎沙门氏菌检测灵敏度为1.4×105cfu/mL。将该方法应用于牛奶样品的检测中，经10小时预培养，检测灵敏度可达1-10cfu/mL。 综上所述，本研究筛选得到了肠炎沙门氏菌纳米抗体，建立了夹心ELISA的分析方法，并成功应用于牛奶样品的检测中，为食源性致病菌的快速检测技术的研究提供了良好的技术支撑。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 引言

1.1 沙门氏菌概述

1.1.1 沙门氏菌生物学特性

1.1.2 沙门氏菌的危害及致病机理

1.1.3 沙门氏菌检测方法研究进展

1.2.1 基因工程抗体

1.2.2 噬菌体展示技术

1.3.1 纳米抗体的发现

1.3.2 纳米抗体的结构

1.3.3 纳米抗体的特性

1.3.4 纳米抗体在食品污染物检测中的应用

1.4研究意义与目的

1.5.1 研究内容

1.5.2 技术路线

第二章 肠炎沙门氏菌噬菌体展示纳米抗体文库的构建

2.1.1 仪器

2.1.2 试剂

2.1.3 主要试剂配制

2.2.1 抗原制备与双峰驼免疫

2.2.2 重链可变区VHH基因的扩增

2.2.3 VHH基因片段与载体pComb3X的酶切与连接

2.2.4 电转化感受态细胞的制备

2.2.5 连接产物的电转化

2.2.6 噬菌体展示纳米抗体文库的构建

2.2.7 噬菌体展示纳米抗体文库的质量鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 抗原制备与双峰驼免疫

2.3.2 重链可变区VHH基因的扩增

2.3.3 VHH基因片段与载体pComb3X的酶切

2.3.4噬菌体展示纳米抗体文库的构建

2.3.5 噬菌体展示纳米抗体文库的质量鉴定

2.4 小结

第三章 肠炎沙门氏菌纳米抗体的制备与特性表征

3.1.1 仪器

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要试剂配制

3.2.1 特异性结合肠炎沙门氏菌纳米抗体的淘选

3.2.2 阳性噬菌体克隆的鉴定

3.2.3 肠炎沙门氏菌纳米抗体的表达及纯化

3.2.4 肠炎沙门氏菌纳米抗体的特异性分析

3.2.5 肠炎沙门氏菌纳米抗体的热稳定性分析

3.3 结果与分析

3.3.1 特异性结合肠炎沙门氏菌纳米抗体的淘选

3.3.2 阳性噬菌体克隆的鉴定

3.3.3 阳性噬菌体克隆的序列分析

3.3.4 肠炎沙门氏菌纳米抗体的表达与纯化

3.3.5 肠炎沙门氏菌纳米抗体的特异性分析

3.3.6 肠炎沙门氏菌纳米抗体的热稳定性分析

3.4 小结

第四章 基于纳米抗体的肠炎沙门氏菌夹心ELISA方法的建立

4.1.1 仪器

4.1.2 试剂

4.1.3 溶液配制

4.2 试验方法

4.2.1 双抗体夹心配对

4.2.2 最适封闭液及封闭时间的选择

4.2.3 包被抗体最佳工作浓度的确定

4.2.4纳米抗体最佳工作及作用时间的确定

4.2.5 抗原最佳反应时间的确定

4.2.6 特异性试验

4.2.7 双抗体夹心ELISA检测方法工作曲线的建立

4.2.8 牛奶样品中肠炎沙门氏菌的检测

4.3 结果与分析

4.3.1 配对抗体的筛选

4.3.2 最适封闭液及封闭时间的选择

4.3.3 包被抗体最佳工作浓度的确定

4.3.4 纳米抗体最佳工作浓度及作用时间的确定

4.3.5 抗原最佳反应时间的确定

4.3.6 特异性试验

4.3.7 双抗体夹心ELISA的工作曲线

4.3.8 牛奶样品中的检测

4.4 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

致谢

个人简历