生长素对苹果糖代谢的影响及苹果MdARP功能的初步研究

摘要

生长素作为六大类激素之一，可直接调控植物的生长发育。同时，植物中可溶性糖的高效代谢会影响碳的高效利用进而也会影响植物的生长发育。探明植物中生长素在调控糖代谢高效利用中的作用，对于植物生长发育调控和果实品质调控有重要意义。本研究以‘嘎啦’（Malus domestica cv.Gala）苹果为材料，研究了生长素对糖代谢的影响；同时克隆了一个苹果中与糖含量相关的生长素抑制蛋白基因MdARP，对其进行生物信息学分析，利用农杆菌介导法，获得了过表达和干扰转基因苹果株系及过表达的转基因番茄株系，对其糖含量和相关表型进行测定，探索MdARP在糖含量调控中的作用。获得的主要结果如下： 1、生长素对苹果糖代谢的影响。利用外源生长素处理苹果茎尖发现，随着生长素浓度的增加，苹果叶片中山梨醇和蔗糖含量逐渐降低，果糖和葡萄糖含量先降低后升高，在此过程中参与糖代谢的MdA6PR、MdSDH1/2和MdFRK2基因的表达水平也是先升高后降低。同时，对垂直徒长枝顶端与水平侧枝的茎尖和成熟叶中糖代谢的分析表明，垂直枝茎尖的山梨醇和蔗糖含量显著低于侧枝茎尖，而葡萄糖和果糖含量无明显差异，并且垂直枝茎尖中参与山梨醇代谢的SDH酶活性和基因表达以及MdA6PR基因的表达都要高于侧枝茎尖，同时参与果糖代谢的FRK的酶活性和MdFRK2基因的表达水平也显著高于侧枝茎尖，而SPS和HxK的酶活性和相关基因的表达要低于侧枝茎尖。这些结果表明，生长素主要是通过调控A6PR、SDH及FRK2的酶活性和基因表达，影响苹果茎尖中山梨醇和果糖的利用能力。 2、MdARP基因ORF全长为360bp，编码119个氨基酸，位于苹果基因组第5号染色体上，属于DRM1/ARP家族，并且含有Auxin-repressed保守结构域。系统发育分析表明，MdARP与沙梨（Pyrus pyrifolia）和水蜜桃（Prunus persica）亲缘关系较近。MdARP基因主要定位于细胞核和细胞质中。MdARP基因在果实中表达量较高，在果实发育过程中表达水平与果糖和蔗糖含量显著正相关。MdARP启动子中含有响应激素和激活分生组织的顺式作用元件，如ABRE、CGTCA-motif、TCA-Element和CAT-box。 3、MdARP在苹果和番茄糖代谢中的作用。通过农杆菌介导法，获得了MdARP过量和干扰转基因苹果株系，其中过表达株系2个，干扰株系3个。对糖含量测定表明，在过量和干扰的转基因苹果中山梨醇、蔗糖和葡萄糖含量均低于野生型，而果糖含量在过表达转基因苹果株系中显著高于野生型，在干扰株系中显著低于野生型。在过表达转基因番茄中，叶片中蔗糖含量降低，而葡萄糖和果糖含量显著增加，但在转基因番茄果实中蔗糖、果糖和葡萄糖含量均显著增加。以上结果可以表明，MdARP可调控果糖和蔗糖的积累。

目录

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缩略表

第一章 文献综述

1.1.1糖代谢与源库关系关系研究

1.1.2源库关系与植物生长发育研究

1.1.2苹果糖代谢的研究进展

1.2.1生长素

1.2.2生长素信号转导途径

1.2.3生长素抑制蛋白ARP（Auxin-repressed protein）研究进展

1.2.4生长素与ARP的关系研究进展

1.3目的和意义

第二章 生长素对苹果糖代谢的调控研究

2.1.1试验材料

2.1.2主要试剂

2.1.3主要引物

2.2试验方法

2.2.1糖含量的测定

2.2.2糖代谢相关酶活测定

2.2.3磷酸己糖含量的测定

2.2.4 RNA的提取与cDNA的合成

2.2.5实时定量PCR分析

2.2.6数据分析

2.3结果与分析

2.3.1外源生长素处理对苹果茎尖糖代谢的影响

2.3.2苹果垂直徒长枝顶端和水平侧枝茎尖与成熟叶中糖代谢的变化

2.4讨论

第三章 苹果MdARP的克隆及转化苹果和番茄研究

3.1.1试验材料

3.1.2试验方法

3.2.1 苹果生长素抑制蛋白基因MdARP序列分析

3.2.2苹果生长素抑制蛋白MdARP组织器官表达特性和与糖相关性分析

3.2.3苹果生长素抑制蛋白MdARP启动子作用元件分析

3.2.4苹果生长素抑制蛋白MdARP的亚细胞定位

3.2.5生长素对MdARP的影响

3.2.6 MdARP过量和干扰表达载体的构建与转基因株系的鉴定

3.2.7MdARP转基因株系中糖代谢的变化

3.3讨论

第四章 结论与创新点

4.1结论

4.2创新点

参考文献

附录

致谢

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