纳米材料G5-cRGD负载siRNA转染精原干细胞技术体系的建立

摘要

精原干细胞是精子发生的基础，位于睾丸曲细精管的基底膜，通过自我更新和分化源源不断地产生精子，以维持整个雄性生命过程中的生育能力。精原干细胞在遗传资源的保存、不孕不育和遗传疾病治疗等方面具有广阔的应用前景。但是脂质体或电转等方法转染精原干细胞的效率都低，限制了精原干细胞的研究与应用。聚酰胺-胺树状大分子（PAMAM）作为一种纳米材料，具有独特的三维结构，它的表面电荷和高密度的表面基团适合配体附着并具有促进靶向递送的作用。鉴于此，本研究以小鼠未分化A型精原细胞来源的C18-4细胞和原代精原干细胞作为研究对象，选择第五代PAMAM（G5）树状大分子，通过酰胺反应修饰cRGD多肽，合成PAMAM-cRGD（G5-cRGD）树状大分子，分析G5-cRGD树状大分子的物理化学特性、细胞毒性、内涵体逃逸能力和基因沉默效率，探究G5-cRGD是否能作为有效的基因递送载体负载siRNA转染精原干细胞，为精原干细胞后续的研究和临床应用奠定基础和提供有效的手段。主要研究结果如下： 1、G5-cRGD能完全结合并负载siRNA。首先，通过红外光谱检测到G5-cRGD成功合成。其次，通过透射电镜观察到G5呈不规则分布，当负载siRNA后能自动包装成球形颗粒，平均粒径在70nm，G5-cRGD-siRNA平均粒径在80nm。凝胶阻滞分析发现，随着N/P比率的增加siRNA条带逐渐减弱。在N/P10条件消失，表明G5和G5-cRGD能完全结合并负载siRNA。 2、与Lipo2000对比，G5-cRGD具有降低细胞毒性的作用。CCK-8检测表明G5-cRGD-siRNA复合物在N/P10条件下细胞活力高于90%，而脂质体Lipo2000转染细胞活力只有60%，因此G5-cRGD对细胞的毒性低。 3、G5-cRGD能有效负载siRNA转染精原干细胞系C18-4细胞，而且溶酶体逃逸能力强。利用激光共聚焦观察和流式分析，表明G5和G5-cRGD能有效负载siRNA转染C18-4细胞。通过FAM标记siRNA（绿色荧光）和溶酶体红色荧光探针定位，发现G5-cRGD-siRNA复合物在24h后开始部分逃逸溶酶体，在36h出现大量释放。表明G5-cRGD能有效促进siRNA从溶酶体中的释放。 4、G5-cRGD主要通过能量依赖的内吞途径进入细胞。经过NaN3和低温条件处理，发现G5-cRGD主要通过能量依赖的内吞途径进入细胞，但也存在被动运输机制。 5、与传统转染试剂Lipo2000相比，G5-cRGD能显著提高小鼠和猪原代精原干细胞中siRNA的递送效率分别达到35%和51%。G5-cRGD负载Cdk1+Cdk2siRNA，干扰组中Cdk1和Cdk2基因的表达均低于对照组，细胞克隆数量相比对照组显著下调，而且生殖细胞中EdU阳性细胞仅为31%，Mock和NC对照组分别为58%和51%，表明能有效沉默靶基因的表达并明显抑制克隆的形成数目和EdU阳性细胞的数量。 综上所述，本试验成功建立了纳米材料G5-cRGD高效转染原代精原干细胞的技术体系。该体系的建立将为精原干细胞的生物学研究、转基因动物制备、遗传资源保存和临床不孕不育的治疗等提供帮助。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1精原干细胞研究综述

1.2 RNA 干扰技术

1.3 基因载体

1.4 聚酰胺-胺树状分子

1.5 本研究的目的和意义

第二章G5-cRGD的合成及表征

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三章 G5-cRGD在精原干细胞系的摄取和负载siRNA的能力

3.1材料与方法

3.2结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 G5-cRGD在原代精原干细胞的摄取和负载siRNA的能力

4.1材料与方法

4.2结果

4.3 讨论

4.4 小结

结论与创新点

结论

创新点

参考文献

致谢

作者简介