犬瘟热病毒适应人SLAM受体的研究及犬瘟热灭活疫苗免疫效果评价

摘要

犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种多种属动物共患传染病，因其引起感染动物发病率高和死亡率高被人们所重视。CD临床症状多样，可以引起发热、结膜炎、神经系统症状等，病程中后期可因细菌引起继发感染。传统宿主包括犬科、鼬科、浣熊科和猫科等。近年来，CD在世界范围内暴发，特别是CD的跨宿主传播引起了人们的重视。作为CDV受体识别蛋白的H蛋白是病毒变异最频繁的蛋白，H蛋白变异导致的抗原漂移可能是CD高发的原因。研究显示，CDV H基因的变异导致病毒适应了新宿主猕猴，有可能突破宿主屏障通过SLAM受体传播给人类，这可能对当今人类公共卫生安全构成威胁。 本研究通过表达绿色荧光蛋白（eGFP）的重组CDV5804Pe株在表达人SLAM受体的Vero细胞（Vero-hSLAM,VHS）上连续传代，最终获得能快速适应人SLAM受体的毒株。病毒H基因测序表明，CDV适应人SLAM受体H基因第540位氨基酸发生改变，即由天冬氨酸（D）突变为甘氨酸（G）。通过构建突变体的真核表达载体和细胞融合试验证实，仅需一个氨基酸的改变就可以使CDV适应人SLAM。本研究通过对适应人SLAM受体的CDV5804Pe毒株（5804Pe-VHS）进行全基因组测序，发现共有3处氨基酸位点发生突变。 CDV不仅有感染新宿主的风险，对传统宿主的免疫防控也提出了新的挑战。CDV是犬的主要病原体，对自然犬群的致死率高达80%，幼龄犬最易感染。目前，接种疫苗被认为是预防犬瘟热最安全有效的方法。传统犬瘟热活疫苗研制于上世纪50-60年代，对全世界犬瘟热的防控作出了巨大贡献。然而部分犬瘟热活疫苗对野生动物（大熊猫、小熊猫、雪貂等）和幼犬仍然具有残余毒力，疫苗安全性不高。其次，伴随当前CDV的频繁变异，传统活疫苗对动物的免疫保护效果也提出质疑。因此，有必要通过研制新型安全高效疫苗（包括弱毒疫苗），以保持犬瘟热疫苗良好的免疫保护效果。免疫佐剂是灭活疫苗的重要组成部分，能够提高灭活疫苗的免疫原性，并诱导宿主产生长期高水平的免疫应答，增强免疫效果，因此犬瘟热灭活疫苗是当前研究热点之一。 本研究将CDV野毒株（106.0TCID50/mL）经β-丙内酯灭活后，通过添加不同疫苗佐剂制备成灭活疫苗，对幼龄比格犬进行3次免疫，免疫后的比格犬使用CDV强毒株攻毒，通过中和抗体测定、临床症状观察、采集口鼻和直肠拭子和组织脏器检测病毒载量等综合评估MONTANIDE GEL02、ADJ-801和Al(OH)3三种佐剂制作的灭活疫苗的免疫效果。结果证实发现MONTANIDE GEL02和ADJ-801佐剂制成的灭活疫苗能够显著增强CDV疫苗在比格犬体内的免疫应答，第三次免疫后中和抗体滴度分别为10.6和40.2，攻毒第14天中和抗体滴度均达512，保护率分别为80%和100%，具有良好的免疫效果，试验为CDV的防控提供了研究素材。

目录

声明

第一章 犬瘟热病毒研究进展

1.1 犬瘟热病毒基因组

1.1.1 核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein N）

1.1.2 磷蛋白（Phospho protein P）

1.1.3 基质蛋白（Matrix protein M）

1.1.4 大蛋白（Large polymerase protein L）

1.1.5 融合蛋白（Fusion protein F）

1.1.6 附着蛋白或血凝素蛋白（Hemagglutinin protein H）

1.2 CDV的变异与跨宿主传播

1.3 犬瘟热的临床症状和病理变化

1.4 犬瘟热的流行病学

1.5 犬瘟热疫苗的研究现状

1.5.1 灭活疫苗

1.5.2 弱毒活疫苗

1.5.3 亚单位疫苗

1.5.4 DNA疫苗

1.6 研究的目的及意义

第二章 犬瘟热病毒适应人SLAM受体的研究

2.1 材料

2.1.1 病毒和细胞

2.1.2 载体与菌种

2.1.3 工具酶与主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 CDV 5804Pe-VHS适应株的获得

2.2.2 CDV 5804Pe-VHS 适应株H基因RBS区分析

2.2.3 H基因真核表达载体的构建

2.2.4 H/F质粒共转染

2.2.5 CDV5804Pe-VHS适应株全基因组测序

2.3.1 CDV 5804Pe株感染Vero-hSLAM细胞

2.3.2 CDV 5804Pe株和5804Pe-VHS株对不同易感细胞的感染能力

2.3.3 5804Pe-VHS H基因RBS区测序比对

2.3.4 H和F基因PCR扩增

2.3.5 H和F基因重组质粒鉴定

2.3.6 细胞融合

2.3.7 5804Pe-VHS全基因组RT-PCR电泳结果

2.3.8 阳性重组克隆PCR鉴定结果

2.3.9 全基因组序列分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 犬瘟热灭活疫苗制备与免疫效果评价

3.1 材料和方法

3.1.1 试验动物与病毒

3.1.2 试验材料

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 灭活疫苗的制备

3.1.5 比格犬免疫

3.1.6 动物攻毒与病料采集

3.1.7 中和抗体的测定

3.1.8 淋巴细胞计数

3.1.9 病料处理及病理学观察

3.1.10 病毒RNA的提取和cDNA的合成

3.1.11 荧光定量PCR测定病毒RNA载量

3.1.12 统计学分析

3.2 结果及分析

3.2.1 CDV攻毒后临床症状

3.2.2 CDV攻毒后病理变化

3.2.3 CDV外周血淋巴细胞数

3.2.4 CDV中和抗体的测定

3.2.5 眼鼻拭子和直肠拭子中CDV RNA含量

3.3 讨论

3.4 小结

结论

参考文献

致谢

个人简历