利用RNA-seq技术分析可变剪接对小鼠早期胚胎发育影响的初步研究

摘要

在小鼠受精卵的植入前发育过程中，存在两个重要的阶段，即母源调控向合子调控的转变（MZT）和早期胚胎的第一次细胞系分化。MZT可触发母源mRNA的降解及合子基因组的转录，而早期胚胎的第一次细胞系分化则形成内细胞团（ICM）及滋养外胚层（TE）两个细胞谱系。相关研究表明，ICM与TE细胞无论是在形态特征、基因表达，还是生物学功能方面都存在一定程度的差异，但是调控受精卵分化为ICM和TE这一生物学过程还未见统一的定论。可变剪接是一种在真核生物中十分普遍的转录后基因表达调控方式，能够将同一基因转录产物剪接为不同的mRNA，因此明显增加了高等真核生物基因组的信息含量及蛋白多样性。近年来，高通量测序技术的发展促进了全基因组可变剪接的分析技术的成熟，使可变剪接的相关研究变得易于实现。在这里，通过生物信息分析探究了可变剪接在小鼠胚胎植入前发育过程中的重要作用。 为了有效地对大量转录组数据进行分析，编写了一键化转录组数据分析系统，并通过该系统分析了小鼠卵母细胞、受精卵、ICM、TE细胞之间基因表达（包括mRNA及lncRNA）及可变剪接的差异。结果表明，在卵母细胞受精形成受精卵的过程中，同时存在可变剪接及基因表达的变化，并且受精卵中可变剪接的事件要多于卵母细胞。对于只在卵母细胞时期发生可变剪接的基因及发生可变剪接并在受精时出现表达变化的基因，其生物学功能可发生部分重叠；对于只在受精卵时期发生可变剪接的基因具有对应的生物学功能，而发生可变剪接并与卵母细胞相比存在表达变化的基因由于数目太少而没有对应的生物学功能，这暗示可变剪接与差异表达可能共同调控了卵母细胞及受精前的发育，而受精后可变剪接与差异表达的共同调控作用消失。另外，在受精卵分化形成ICM/TE过程中，基因表达及可变剪接（包括可变剪接模式与数量）的变化仍然同时存在，对受精卵/ICM、受精卵/TE特异的差异可变剪接事件对应的基因进行功能富集分析的结果进一步显示，这些基因可能通过对细胞周期的调控，在第一次分化过程中发挥重要作用；而ICM/TE、受精卵/ICM、受精卵/TE各组内基因表达量的变化暗示基因表达水平的变化可能导致了受精卵的命运分化，最终形成ICM及TE两种细胞。在受精卵分化形成ICM/TE过程中，Prc1、Lin37及Vrk1是可变剪接差异最显著的3个基因，针对这三个基因进行了表达敲降试验，以试图阐释发生可变剪接的基因是否会对小鼠胚胎发育产生影响。结果表明，当Vrk1，Lin37和Prc1的表达存在缺失时，小鼠胚胎的卵裂率和囊胚率显著降低，说明它们对小鼠早期胚胎发育来说是不可或缺的，当其被敲降时，相应的可变剪接调控随之消失，进一步说明基因特异的表达及可变剪接对小鼠植入前胚胎的发育是十分重要的。 在卵母细胞时期可变剪接与差异表达协同调控卵母细胞及受精前的发育；受精后，可变剪接与差异表达的协调作用消失。可变剪接可能通过影响细胞的分裂及分化而影响小鼠胚胎的发育。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 小鼠植入前胚胎发育过程

1.2 测序技术的发展

1.3 可变剪接的研究进展

第二章 一键化转录组数据分析系统

2.1 前言

2.2 试验方法

2.3 试验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 小鼠卵母细胞与受精卵基因差异表达及可变剪接分析

3.1 前言

3.2 试验仪器与材料

3.3 试验方法

3.4 试验结果

3.5.讨论

3.6.小结

第四章 受精卵与ICM/TE基因表达及可变剪接的差异变化

4.1 前言

4.2 试验仪器与材料

4.3 试验方法

4.3 试验结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 发生可变剪接的基因对小鼠胚胎发育的影响

5.1 前言

5.2 试验仪器与材料

5.3 试验方法

5.4 试验结果

5.5 讨论

5.6 小结

第六章 结论

6.1结论

6.2本文创新点

6.3进一步研究的课题

附录

附录A 仅在卵母细胞时期发生可变剪接的基因的生物学功能

附录B 卵母细胞时期与受精卵时期重叠可变剪接事件的基因的功能富集

附录C 仅在受精卵时期发生可变剪接的基因的生物学功能

附录D 仅在卵母细胞时期发生可变剪接的基因的生物学功能

附录E 仅发生表达变化却在卵母细胞中不发生可变剪接基因的生物学功能

附录F 在卵母细胞时期发生可变剪接并且表达量差异的基因的生物学功能

附录G 在受精卵时期发生可变剪接的基因的生物功能

附录H仅发生表达变化却在受精卵中不发生可变剪接的基因的生物学功能

附录I 在受精卵时期发生可变剪接并且表达量差异的基因的功能富集

附录J 受精卵/ICM和受精卵/TE中差异可变剪接的功能富集

参考文献

致谢

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