环状RNA CircKIAA在奶牛乳腺炎组织中的表达及其在乳腺上皮细胞中的作用

摘要

奶牛乳腺炎在奶牛养殖业中具有较高的发病率和感染率，不仅可导致产奶量和牛奶质量下降，还可降低奶牛的产奶年限，对奶牛业的发展造成了巨大的影响。研究表明环状RNA(circRNA)在多种炎症中可作为生物标记物和治疗靶点，然而circRNA是否可作为奶牛乳腺炎的潜在治疗的靶点尚不明确。 实验室前期建立了大肠杆菌诱导的乳腺炎细胞模型，通过高通量测序筛选了一批差异表达的circRNAs，生物信息学分析发现其中一条circRNA与细胞免疫应答及增殖相关。鉴于KIAA0556为该circRNA的基因标记，因此将其命名为circKIAA。本研究首先对获取的乳腺炎患牛和正常奶牛的乳腺组织进行了病理学及残留乳汁中病原菌的分离及鉴定，通过实时荧光定量PCR检测并比较了circKIAA在正常和大肠杆菌为主要分离菌的炎性乳腺组织的表达水平，发现circKIAA在奶牛炎性乳腺组织的表达水平明显高于正常乳腺组织。在大肠杆菌毒力成分脂多糖（LPS）诱导的体外乳腺炎细胞模型中，circKIAA的表达水平同样高于正常对照组。然后建立了稳定过表达circKIAA的奶牛乳腺上皮细胞系，通过实时荧光定量PCR、流式细胞凋亡术、CCK-8细胞活力检测实验、EDU细胞增殖实验等一系列实验方法研究了circKIAA对奶牛乳腺上皮细胞的炎性应答、增殖和凋亡等的影响。结果发现过表达circKIAA可增强LPS诱导的炎性细胞因子TNF-a、IL-1β和IL8的表达、抑制乳腺上皮细胞的增殖并诱导凋亡。软件miRBase预测circKIAA可结合miR-326，而miRanda和Targetscan软件预测Bcl-2为miR-326的潜在作用靶点之一。实验进一步的研究发现Bcl-2的表达量在过表达circKIAA组中低于正常对照组；实验进一步的研究发现Bcl-2的表达量在过表达circKIAA组中低于对照组，在共同过表达circKIAA和miR-326的细胞组中低于单独过表达circKIAA组，表明circKIAA通过发挥对miR-326的“海绵”作用调控Bcl-2的表达，促进奶牛乳腺上皮细胞的凋亡并抑制增殖。 综上所述，炎症状态下circKIAA在奶牛乳腺组织和乳腺上皮细胞中的表达水平均明显增高，进而参与奶牛乳腺的炎症反应过程。炎性状态下高表达circKIAA通过miR-326的“海绵”作用以及Bcl-2的表达调控奶牛乳腺上皮的增殖和凋亡过程，这一研究结果为奶牛乳腺炎的防治提供了新的可能治疗靶点。

目录

声明

第一章 引言

1.1.1 乳腺炎的病因

1.1.2 乳腺炎的诊断

1.1.3 奶牛乳腺炎的病理机制

1.1.4奶牛乳腺炎的免疫机制

1.1.5 奶牛乳腺炎的治疗

1.2.1 CircRNA概述

1.2.2 CircRNA与疾病

1.2.3 CircRNA与miRNA

1.2.4 牛CircRNA的研究现状

第二章 CircKIAA在奶牛乳腺炎组织中的表达及其在乳腺上皮细胞中的作用

2.1 材料

2.1.1乳腺上皮细胞和乳腺组织

2.1.2常规耗材

2.1.3主要试剂

2.1.4仪器设备

2.2方法

2.2.1主要溶液的配制

2.2.2 牛奶中病原菌的分离鉴定

2.2.3炎性细胞模型的建立

2.2.4 石蜡切片的制备

2.2.5 细胞培养

2.2.6 circKIAA表达载体的构建

2.2.7实时荧光定量PCR的检测

2.2.8细胞转染

2.2.9 细胞凋亡实验

2.2.10细胞活性检测

2.2.11细胞增殖实验

2.2.12 统计分析

2.3.1 CircKIAA在奶牛乳腺组织及乳腺上皮细胞的表达

2.3.2 CircKIAA过表达载体的构建

2.3.3 过表达CircKIAA的MAC-T细胞系的建立

2.3.4 CircKIAA参与炎性状态下MAC-T细胞的免疫应答

2.3.5 CircKIAA诱导MAC-T细胞发生凋亡

2.3.6 CircKIAA抑制MAC-T细胞的活力

2.3.7 CircKIAA抑制MAC-T细胞的增殖

2.3.8 CircKIAA对miR-326的“海绵”作用

2.4讨论

全文总结

创新之处

参考文献

致谢

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