克氏柠檬酸杆菌的生物学特性及其鞭毛素基因fliC的功能

摘要

奶牛乳房炎是世界范围内给奶牛养殖业带来巨大的经济损失的常见疾病，病原微生物感染是奶牛乳房炎发生的主要原因，目前已报道的病原微生物多达150种。克氏柠檬酸杆菌（Citrobacter koseri，C.koseri）是一种环境条件致病菌，最早认为是奶牛肠道菌群的正常寄居菌，近年来多个国家已从奶牛乳房炎的乳样中分离到了该菌，但缺乏进一步的研究，对C.koseri生物学特性和鞭毛素基因fliC的功能认识不清。本试验对奶牛乳房炎样品进行了C.koseri的分离鉴定和生物学特性研究，构建了鞭毛素基因fliC的突变株，进行了鞭毛素基因fliC的功能验证，取得了以下结果： 1.从奶牛乳房炎分离到1株G-杆菌，经形态学检查、生化鉴定、16S rRNA序列测定和系统进化分析，确定该菌为C.koseri，将其命名为CKO-WT99。 2.CKO-WT99可引起小鼠死亡和小鼠乳房炎，是奶牛乳房炎的致病菌。CKO-WT99对青霉素和氨苄西林耐药，对其他抗生素敏感；CKO-WT99可作为受体菌接受blaCTX-M-55，并通过接合转移将blaCTX-M-55转移到野生型的E.coli中；CKO-WT99具有运动性，含有鞭毛素基因fliC；CKO-WT99生物被膜主要成分为卷曲菌毛和纤维素。 3.以CKO-WT99基因组为模板，使用重叠PCR的方法将fliC上下游同源臂融合到一块，将融合片段克隆到自杀性质粒pRE112上，构建出重组自杀性质粒pREΔfliC，以E.coli X7213（含重组自杀性质粒pREΔfliC）为供体菌，CKO-WT99为受体菌进行共培养，两步法筛选出缺失株ΔfliC，并使用自杀性质粒pRE112对ΔfliC进行了回补。 4.CKO-WT99、缺失株ΔfliC、ΔfliC-C三株菌生化特性和生长特性基本没有差别；缺失株ΔfliC与CKO-WT99相比生物被膜形成能力下降、丧失运动性、不形成鞭毛、毒力降低，回补株ΔfliC-C基本恢复这些能力，说明鞭毛素基因fliC是C.koseri的结构基因和毒力基因。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 文献综述

1.1 克氏柠檬酸杆菌的研究进展

1. 1. 1 大肠埃希菌、沙门氏菌和克氏柠檬酸杆菌的生物被膜研究现状

1. 1. 2 克氏柠檬酸杆菌β-内酰胺酶的耐药现状

1.2 鞭毛的研究进展

1. 2. 1 鞭毛介导的运动性和趋化性

1. 2. 2 鞭毛在黏附和侵袭中的作用

1. 2. 3 鞭毛基因与毒力基因协调表达

1. 2. 4 鞭毛对生物被膜的作用

1. 2. 5 鞭毛调节真核细胞的免疫系统

1.2.6 鞭毛素基因fliC的研究

第二章 克氏柠檬酸杆菌的生物学特性

2.1 材料

2. 1. 1 乳样采集

2. 1. 2 主要试剂、试剂盒及仪器

2. 1. 3 试验动物和菌株

2. 1. 4 引物

2.2 方法

2.2.1 CKO-WT99的分离及生化鉴定

2.2.2 16S rRNA基因序列的扩增及系统发育树的构建

2. 2. 3 小鼠致病性试验

2.2.4 CKO-WT99感染对小鼠乳腺组织的损伤

2.2.5 CKO-WT99的耐药性试验

2. 2. 6 接合转移试验

2.2.7 CKO-WT99运动性分析

2.2.8 CKO-WT99生物被膜主要成分检测

2.2.9 CKO-WT99鞭毛和生物被膜有关基因的检测

2.3.1 CKO-WT99的分离与生化鉴定

2.3.2 16S rRNA基因序列分析及系统发育树的构建

2. 3. 3 小鼠致病性试验

2.3.4 CKO-WT99感染对小鼠乳腺组织的损伤

2.3.5 CKO-WT99的耐药性试验

2. 3. 6 接合转移试验

2.3.7 CKO-WT99运动性检测

2.3.8 CKO-WT99生物被膜主要成分检测

2.3.9 CKO-WT99鞭毛和生物被膜有关基因的检测结果

2.4 讨论

2.4.1 CKO-WT99的分离鉴定

2.4.2 CKO-WT99的生物学特性研究

2.5 小结

第三章 克氏柠檬酸杆菌鞭毛素基因fliC的功能

3.1 材料

3. 1. 1 菌株与质粒

3. 1. 2 主要试剂、试剂盒及仪器

3. 1. 3 试验动物

3. 1. 4 引物

3.2 方法

3.2.1 CKO-WT99的复苏及基因组的提取

3.2.2 PCR产物和酶切产物的纯化回收

3. 2. 3 质粒小提

3.2.4 缺失株ΔfliC的构建

3.2.5 回补株ΔfliC-C的构建

3.2.6 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C的生化特性

3.2.7 缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C的遗传稳定性

3.2.8 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C生长特性

3.2.9 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C鞭毛形态观察

3.2.10 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C运动性检测

3.2.11 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C生物被膜半定量检测

3.2.12 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C LD50检测

3. 2. 13 统计学分析

3.3 结果与分析

3. 3. 1 重组自杀性质粒的构建

3.3.2 缺失株ΔfliC的构建及鉴定

3.3.3 回补株ΔfliC-C的构建

3.3.4 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C生化特性

3.3.5 缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C的遗传稳定性

3.3.6 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C生长特性

3.3.7 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C鞭毛形态观察

3.3.8 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C运动性检测

3.3.9 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C生物被膜半定量检测

3.3.10 CKO-WT99、缺失株ΔfliC和回补株ΔfliC-C LD50检测

3.4 讨论

3.4.1 CKO-WT99鞭毛素基因fliC的功能研究

3.4.2 CKO-WT99缺失株的构建

3.4.3 CKO-WT99回补株的构建

3.5 小结

第四章 结论

附录A CKO-WT99 16S rRNA序列

参考文献

致谢

个人简历