草鱼呼肠孤病毒II型结构蛋白的鉴定及部分结构蛋白的免疫原性分析

摘要

草鱼呼肠孤病毒（Grass Crap Reovirus，GCRV）引起的草鱼出血病（grass carp hemorrhage disease，GCHD）是严重危害我国草鱼养殖业健康发展的一种烈性传染病，每年可引起大量草鱼死亡而导致巨大的经济损失，被农业部列为二类动物疫病。GCRV基因组由11个分节段的dsRNA组成，基于病毒基因组序列差异，GCRV总体上可分为3个基因型，近年流行的基因Ⅱ型是当前草鱼出血病的主要病原。GCRV11个基因节段均编码相应的功能蛋白，但GCRVⅡ型各节段基因编码蛋白的功能尚缺乏系统研究，前期主要是通过生物信息数据库分析和预测所得，不同研究者的结果出入较大，给GCRVⅡ型的病毒学基础研究、基因工程疫苗的研制等均造成了困扰。本论文利用病毒纯化、LC-MS/MS、抗体制备、Western-blot、IFA等技术及鱼体试验对GCRVⅡ型11个基因节段编码蛋白进行鉴定及目标蛋白进行免疫原性分析，旨在为GCRVⅡ型病毒的病原学基础研究及基因工程疫苗等防控产品的开发提供理论依据。研究内容及结果如下： 1.病毒纯化及LC-MS/MS分析：用GSB细胞大量扩增GCRVⅡ型病毒，然后采用蔗糖密度梯度离心法进行病毒纯化，LC-MS/MS分析纯化的GCRVⅡ型病毒。结果显示，可检测到其中9个基因节段编码蛋白的肽段信号，蛋白丰度由高到低分别为S6、S4、S3、S9、S1、S10、S11、S2、S5基因编码的蛋白，说明这9个基因节段编码蛋白可能为病毒的结构蛋白，且S6、S4基因编码蛋白可能为病毒的主要结构蛋白；而未检测到S7、S8基因编码蛋白的肽段信号，这两个基因节段编码蛋白可能为病毒的非结构蛋白。 2.抗体制备及结构蛋白鉴定：实验室前期已制备并保存了抗S1～S4、S6～S8、S10、S11基因编码蛋白的抗体；本研究新构建了S5、S9基因编码蛋白的重组原核表达载体，诱导并纯化重组的S5、S9基因编码蛋白，制备了抗S5、S9基因编码蛋白的多克隆抗体。将11个抗体与纯化的GCRVⅡ型病毒粒子进行Western blot检测，结果显示，抗S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11编码蛋白的抗体与病毒粒子反应呈阳性，而抗S2、S5、S7、S8基因编码蛋白的抗体与病毒粒子反应呈阴性；将GCRVⅡ型病毒感染GSB细胞后分别用11个抗体进行IFA检测，结果与Western blot的结果一致；采用中和试验分析7个呈阳性反应抗体的中和活性，将稀释后的抗体分别与GCRVⅡ型病毒液等体积混合孵育后感染GSB细胞，RT-qPCR检测感染后的病毒含量。结果显示，与抗S6、S9、S10、S11基因编码蛋白抗体作用的其病毒含量显著降低，其中病毒含量最低的为抗S9基因编码蛋白抗体。说明这4个抗体均有一定的中和活性，其中中和活性最强的为抗S9基因编码蛋白抗体。 3.S4、S9基因编码蛋白免疫原性研究：将纯化的S4、S9基因编码蛋白单独或与Seppic Gel佐剂乳化后腹腔注射免疫草鱼。在一免和二免21d后分别采集草鱼血清、脾脏和头肾组织，通过间接ELISA方法检测草鱼血清的特异性IgM抗体水平变化，通过相对定量PCR方法检测脾脏和头肾中IFN、TLR-3、TLR-7、Mx、IgM基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，S4、S9基因编码蛋白加佐剂免疫组草鱼血清OD450nm值范围为0.6～0.8，S4、S9基因编码蛋白免疫组草鱼血清OD450nm值范围为0.3～0.5，佐剂组和空白对照组OD450nm值均小于0.2；S4、S9基因编码蛋白加佐剂免疫组5个免疫因子基因mRNA的表达水平约是对照组的7～45倍，蛋白加佐剂免疫组血清中特异性抗体水平和组织中免疫因子的mRNA表达水平与对照组相比均显著升高（P＜0.05），蛋白免疫组组织中免疫因子mRNA表达水平与对照组相比无明显变化（P＞0.05）；攻击感染试验结果表明，S4基因编码蛋白加佐剂免疫组的相对保护率为37.9%，S9基因编码蛋白加佐剂组的相对保护率为34.9%，均对草鱼具有一定的免疫保护作用。 综上所述，GCRVⅡ型病毒的S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11基因节段编码的蛋白可能为病毒的结构蛋白，S2、S5、S7、S8基因编码的蛋白可能为病毒的非结构蛋白，其中S4和S6编码的可能为病毒主要结构蛋白，S9编码蛋白具有较强的中和活性；S4和S9编码蛋白具有较好的免疫原性，对草鱼感染GCRVⅡ型强毒株具有一定的免疫保护作用，为基因工程疫苗开发筛选候选抗原提供了依据。 的为抗S9基因编码蛋白抗体。说明这4个抗体均有一定的中和活性，其中中和活性最强的为抗S9基因编码蛋白抗体。 3.S4、S9基因编码蛋白免疫原性研究：将纯化的S4、S9基因编码蛋白单独或与Seppic Gel佐剂乳化后腹腔注射免疫草鱼。在一免和二免21d后分别采集草鱼血清、脾脏和头肾组织，通过间接ELISA方法检测草鱼血清的特异性IgM抗体水平变化，通过相对定量PCR方法检测脾脏和头肾中IFN、TLR-3、TLR-7、Mx、IgM基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，S4、S9基因编码蛋白加佐剂免疫组草鱼血清OD450nm值范围为0.6～0.8，S4、S9基因编码蛋白免疫组草鱼血清OD450nm值范围为0.3～0.5，佐剂组和空白对照组OD450nm值均小于0.2；S4、S9基因编码蛋白加佐剂免疫组5个免疫因子基因mRNA的表达水平约是对照组的7～45倍，蛋白加佐剂免疫组血清中特异性抗体水平和组织中免疫因子的mRNA表达水平与对照组相比均显著升高（P＜0.05），蛋白免疫组组织中免疫因子mRNA表达水平与对照组相比无明显变化（P＞0.05）；攻击感染试验结果表明，S4基因编码蛋白加佐剂免疫组的相对保护率为37.9%，S9基因编码蛋白加佐剂组的相对保护率为34.9%，均对草鱼具有一定的免疫保护作用。 综上所述，GCRVⅡ型病毒的S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11基因节段编码的蛋白可能为病毒的结构蛋白，S2、S5、S7、S8基因编码的蛋白可能为病毒的非结构蛋白，其中S4和S6编码的可能为病毒主要结构蛋白，S9编码蛋白具有较强的中和活性；S4和S9编码蛋白具有较好的免疫原性，对草鱼感染GCRVⅡ型强毒株具有一定的免疫保护作用，为基因工程疫苗开发筛选候选抗原提供了依据。

目录

主要符号对照表

文献综述

1.1 草鱼呼肠孤病毒研究进展

1.2 草鱼呼肠孤病毒基因组研究进展

1.3 主要研究内容及目的

试验研究

第二章 LC-MS/MS分析GCRV基因组编码蛋白

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 草鱼呼肠孤病毒结构蛋白的鉴定

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 GCRV S4和S9基因编码蛋白免疫原性研究

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

个人简历