MCRS1、CDX2和NANOG在体外受精和核移植牛囊胚内细胞团及滋养层细胞中的表达

摘要

胎盘发育异常是目前公认的导致克隆牛体内发育失败的主要原因，而越来越多的证据表明在囊胚阶段滋养层和内细胞分化异常是引起胎盘发育异常的关键因素。哺乳动物的早期胚胎第一次细胞分化过程极其复杂，受到多种调控因子的影响，其中MCRS1、CDX2、NANOG在胚胎发育过程中起着十分重要的作用。MCRS1主要参与细胞的增殖和转化；CDX2在胚胎发育过程中的主要作用是维持胚胎生长、诱导细胞分化和器官的形成；NANOG基因对早期胚胎中胚胎干细胞的自我更新以及维持细胞多潜能性发挥着关键性的作用，其被认为是全能型或者多能性干细胞的重要标志物。截止目前，有关MCRS1、CDX2和NANOG在体外受精（In vitro fertilization,IVF）以及核移植囊胚内细胞团（ICM）和滋养层（TE）细胞的表达模式和作用的研究尚不够完善，主要原因是囊胚的内细胞团和滋养层细胞不易完全分离开来进行针对性的检测分析。本研究通过体外受精和核移植技术获得IVF和核移植囊胚，然后通过磁珠分选的方法分离纯化囊胚的ICM和TE细胞；进一步运用qRT-PCR技术研究两种囊胚的ICM和TE细胞中MCRS1、CDX2和NANOG的mRNA表达规律和差异，探讨分析MCRS1、CDX2和NANOG对牛早期胚胎发育过程中胚胎生长发育和细胞分化的影响。结果如下： 1.通过磁珠分选技术将囊胚中的ICM和TE细胞进行分离，将两者以ConA-FITC和Hoescht33342予以标记，荧光显微镜下观察区分出两种不同的细胞，即被两者都标记的为TE细胞，仅被Hoescht33342标记的为ICM细胞。结果显示该法能有效分离两种细胞。统计学分析结果表明ICM的纯度为89.9%±1.0%，TE细胞的纯度为90.3%±1.0%，说明建立的分选方法可用于后续试验，为接下来研究ICM和TE细胞中基因表达奠定了基础。 2.荧光定量PCR结果显示，在IVF囊胚中，MCRS1mRNA和CDX2mRNA在TE细胞中的相对表达量均显著高于它们在ICM细胞的表达量；而NANOG mRNA则呈现相反的结果，其在ICM细胞中的相对表达量明显高于TE细胞。 3.在核移植囊胚，荧光定量PCR结果显示，MCRS1mRNA在TE细胞中的相对表达量显著高于ICM细胞的表达量，但显著低于IVF中的相对表达；CDX2mRNA在TE细胞的相对表达量显著高于ICM细胞的表达量，但与IVF囊胚的无明显差异；NANOG mRNA在ICM细胞中的表达量显著高于TE细胞中的表达量，但较IVF囊胚中的相对表达量略低。 结论：在奶牛胚胎发育的早期，囊胚出现胚胎发育的第一次分化，ICM和TE细胞中MCRS1、CDX2和NANOG等三种基因呈差异性表达；MCRS1和CDX2mRNA在IVF和核移植的囊胚中TE细胞的相对表达量均高于ICM细胞，前者在核移植囊胚中的相对表达量较IVF的低，CDX2mRNA在两种囊胚无明显的表达差异，表明MCRS1和CDX2对牛早期胚胎发育中滋养层细胞的分裂分化起着重要作用，MCRS1对核移植胚胎发育具有重要影响。NANOG mRNA在牛IVF和核移植囊胚ICM细胞中的相对表达量均显著高于TE细胞的相对表达量，其在核移植囊胚中的相对表达量要低于IVF囊胚，提示NANOG对维持胚胎细胞的多潜能性及分裂成胚体起着关键性作用。

目录

第一章 文献综述

1.1 哺乳动物早期胚胎发育调控研究进展

1.2 MCRS1 、CDX2和NANOG基因研究概况

第二章 体外受精牛囊胚ICM和TE细胞的分离

2.1材料和方法

2.2 试验方法

2.3结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 MCRS1、CDX2和NANOG在IVF牛囊胚中ICM和TE细胞中的表达研究

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章MCRS1、CDX2和NANOG在IVF和核移植囊胚ICM和TE细胞中的表达差异

4.1材料

4.2方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

结论

创新点和后续研究

参考文献

附录

致谢

个人简介