小麦脱氢抗坏血酸还原酶DHAR基因的克隆与功能分析

摘要

维生素C（Vc）又名L-抗坏血酸（AsA），能够去除细胞内的有毒活性氧ROS，也参与叶黄素循环和维生素E的再生，在动植物体内有重要的代谢和抗氧化功能。对于人类来说，维生素C只能通过每天有规律的饮食来获取，因为维生素C不能在人体中合成和储存，所以提高植物中维生素C的含量对人类健康有重要意义。脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）作为维生素C代谢循环过程中的关键酶，能够催化还原型谷胱甘肽将维生素C代谢的中间产物脱氢抗坏血酸（DHA）还原为AsA，从而减少AsA的流失，增加其含量。本试验以小麦为试验材料，克隆出小麦的DHAR基因，构建Ubi-DHAR过表达载体，再通过基因枪转化、组织培养、PCR阳性验证等获得阳性植株，并从表达量等分子水平和抗坏血酸含量及酶活性等生理水平对T1代转基因植株进行试验，同时对植株进行旱胁迫和氧化胁迫试验，研究其抗逆性。该试验通过在小麦中过表达的DHAR基因，提高其维生素C的含量，增加其营养价值，同时也增强小麦的抗逆能力，为植物抗逆育种提供思路。获得的主要结果如下： 1、从小麦中克隆了DHAR基因的3个拷贝，选取其中表达水平较高的拷贝构建以Ubi为启动子的过表达载体（Ubi-DHAR）。 2、通过基因枪转化技术将载体（Ubi-DHAR）转入小麦幼胚，经过小麦组织培养、PCR阳性鉴定，得到了转基因小麦株系。 3、分子和生理试验分析转基因植株中的DHAR基因的表达量、DHAR酶活性、维生素C含量、DHA含量，以及AsA/DHA。结果表明在叶片和种子中DHAR基因表达量均有不同程度的升高，而叶片中AsA的含量和AsA/DHA较种子中的升高较明显。转基因植株的DHAR酶活性增加到野生型植株的2.5倍左右。 4、对T1代转基因植株进行初步抗逆性试验分析，结果表明转基因植株的抗旱性和抗氧化性都比野生型有一定程度的提高。初步结果表明过表达DHAR基因，增加AsA含量，对提高小麦的抗逆性有重要意义。

目录

主要符号对照表

第一章 文献综述

1.2 高等植物中AsA的合成与代谢

1.3 脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的研究进展

1.4研究的意义和目的

第二章 材料与方法

2.2 DHAR基因的克隆

2.3 基因序列分析

2.4 过表达载体的构建

2.5 Ubi-DHAR载体基因枪转化小麦幼胚

2.6 转基因小麦植株的PCR检测

2.7 DHAR基因表达量测定

2.8 转基因小麦植株的生理指标的测定

2.9 转基因小麦植株的抗逆性试验

第三章 试验结果

3.2 DHAR生物信息学分析

3.3 转基因小麦的分子检测

3.4 转基因小麦抗坏血酸含量及酶活性分析

3.5 转基因小麦抗逆性初步分析

第四章 讨论

4.2 DHAR的过表达对其活性和AsA含量的影响

4.4 过表达DHAR基因增强植株抗逆性的可能性分析

4.5 进一步研究问题

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

个人简历