禽腺病毒血清4型入侵LMH细胞途径的研究

摘要

禽肝炎-心包积液综合征（Hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS）是由禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype4，FAdV-4）引起的一类急性高致病性传染病。自2015年中国爆发以来，迅速传播蔓延至全国。目前，关于FAdV-4的研究还主要集中在病毒基因组分析、病原检测等方面，有关FAdV-4在宿主细胞上的增殖特性及入侵途径还尚不明确。本研究选取鸡肝癌细胞（Leghorn male hepatocellular cells，LMH）作为研究对象，进行了FAdV-4在LMH细胞上增殖规律及入侵途径的研究，从而对FAdV-4入侵宿主细胞的机制研究提供了理论基础。结果如下： （1）不同感染复数的FAdV-4接种LMH细胞后的增殖规律有较大差异。用FAdV-4感染LMH细胞后，通过Real-time PCR及Western blot检测FAdV-4病毒拷贝数及Hexon蛋白表达量。研究发现，以MOI=1接种LMH细胞后，FAdV-4病毒拷贝数及Hexon蛋白表达量在感染后72h到达最高。以MOI=10接种LMH细胞后，Hexon蛋白表达量在感染后12h内不断升高，并在12h达到最高，在24h有所下降。通过入侵动力学试验及激光共聚焦显微镜观察，发现FAdV-4完成对LMH细胞的入侵需要约60min。 （2）FAdV-4入侵LMH细胞不依赖胞内酸性环境但需要发动蛋白（Dynamin）参与。用胞内酸性环境抑制剂氯化铵（NH4Cl），氯喹（Chloroquine）及Dynamin抑制剂3-羟基-2-萘甲酸（Dynasore）分别处理LMH细胞2h后，接种FAdV-4，进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示，与对照组相比，NH4Cl和Chloroquine处理组中代表病毒粒子的特异性绿色荧光没有明显胞膜聚集现象，Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数也未显著下降。表明FAdV-4入侵LMH细胞不依赖胞内酸性环境。Dynasore处理组中代表病毒粒子的特异性绿色荧光有明显胞膜聚集现象，同时Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数也显著下降。表明FAdV-4入侵LMH细胞需要Dynamin分子参与。 （3）FAdV-4入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径。FAdV-4感染LMH细胞后进行透射电镜观察，发现了内吞作用的存在。用网格蛋白抑制剂氯丙嗪（CPZ）处理LMH细胞2h后，接种FAdV-4，进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示，与对照组相比，病毒粒子的定位无明显差异，Hexon蛋白的表达量和病毒拷贝数也无显著变化。表明FAdV-4入侵LMH细胞不依赖网格蛋白介导的内吞途径。用小窝蛋白抑制剂制霉素（Nystatin）和甲基-β-环糊精（MβCD）处理LMH细胞2h后，接种FAdV-4，进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示，代表病毒粒子的特异性绿色荧光有明显胞膜聚集现象，Hexon蛋白表达量和病毒拷贝数均显著下降，表明FAdV-4入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径。 （4）FAdV-4入侵LMH细胞还依赖巨胞饮途径且需要PI3K分子的参与。用巨胞饮途径的抑制剂阿米洛利（EIPA）及相关分子PI3K的抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）处理LMH细胞2h后，接种FAdV-4，进行激光共聚焦观察并检测Hexon蛋白表达量及病毒拷贝数变化。结果显示，与对照组相比，代表病毒粒子的绿色荧光明显聚集在胞膜，Hexon蛋白表达量和病毒拷贝数均显著下降，表明FAdV-4入侵LMH细胞还依赖巨胞饮途径且需要PI3K分子的参与。 综上所述，本研究发现FAdV-4入侵LMH细胞依赖于小窝蛋白介导的内吞途径及巨胞饮途径且需要Dynamin与PI3K分子的参与，但无pH依赖性。这为新型抗病毒药物的靶点选择提供了新的思路。

目录

主要符号对照表

文献综述

第一章 禽腺病毒血清4型及细胞入侵途径的研究进展

1.1 禽腺病毒血清4型研究进展

1.2 病毒入侵细胞途径的研究进展

1.3 本研究的目的与意义

试验研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 FAdV-4入侵LMH细胞途径的研究

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

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