PEDV感染的猪小肠上皮细胞miRNA组学分析和miR-221-5p与miR-615对病毒复制的影响及机制

摘要

猪流行性腹泻病毒（Procine epidemic diaherra virus，PEDV）属于冠状病毒科α冠状病毒属，是一种单股正链RNA病毒，能够引起猪流行性腹泻（Procine epidemic diaherra，PED）。1971年PEDV发现于欧洲，1978年比利时分离到经典毒株CV777。2010年新出现的PEDV突变株引起仔猪急性水样腹泻，病死率高达80％～100％，给世界和中国养猪业造成了巨大的经济损失。microRNAs（miRNAs）是一类多功能的小RNA，一些miRNAs在病毒的感染过程中通过调控宿主的天然免疫而发挥抗病毒作用。本文分离鉴定了一株PEDV毒株，进行了PEDV感染猪小肠上皮细胞（swine intestinal epithelial cells,SIEC）的miRNAs组学分析，然后重点研究了miR-221-5p和miR-615对PEDV复制过程的影响及机制，获得了以下结果： 1.PEDV区域流行毒株的分离鉴定和全基因序列的分析 本研究从临床PEDV阳性病料中分离到了一株PEDV毒株，进行了全基因组测序和分析，结果显示，病毒基因组全长28063nt，包括5’（300nt）和3’（500nt）的非翻译区；全基因组进化分析发现，该毒株属于G2流行毒株组，与近年分离的毒株亲缘关系最近；该毒株S基因没有出现插入和删除，ORF3基因也没有发生缺失。将分离鉴定的PEDV毒株命名为CH/HBTS/2017。 2.PEDV感染的SIEC miRNAs组学分析 （1）用疫苗毒株CV777和ORF3缺失的强毒株NW17感染SIEC后，应用高通量测序方法鉴定miRNAs的表达差异。结果显示，不同毒力的PEDV毒株感染SIEC后均改变了细胞miRNAs的表达谱。共鉴定了229个miRNAs成熟体和232个前体。表达分析表明，CV777vs.Mock有102个差异miRNAs，NW17vs.Mock组有97个差异miRNAs，其中有78个miRNAs在这两组差异基因中同时出现。 （2）对差异的miRNAs进行靶基因预测，并将靶基因进行GO和KEEG分析，结果显示NF-κB、MAPK、TLR等信号通路参与了PEDV感染的过程，进一步分析发现NF-κB通路具有最高的富集分数。 3.miR-221-5p通过靶向病毒基因组和激活NF-κB通路抑制病毒的复制 （1）应用ViTa数据库预测靶向病毒基因组的miRNAs，发现miR-221-5p同时靶向30个PEDV毒株3’端最保守的区域。利用miR-221-5p模拟物，转染SIEC、Vero和Marc-145细胞后都可以抑制PEDV复制，并且在Marc-145细胞中的抑制作用最强。 （2）发现miR-221-5p可以与病毒3’UTR靶标区域结合。与天然免疫缺陷的Vero细胞相比，miR-221-5p在Marc-145细胞中发挥更强的抑制PEDV复制的作用。上调IFN-α、IFN-β和干扰素刺激基因ISG15的表达。进一步研究发现，miR-221-5p主要通过影响NF-κB通路发挥作用，证明NF-κB的启动子被激活；确认p65的核转位增加，进一步探明p65的入核是由于IκB的减少所致。 （3）用Targetscan程序进一步预测了miR-221-5p的靶基因，筛选了5个在NF-κB通路的靶基因，双荧光素酶报告基因试验显示，miR-221-5p可以与SOCS1和NFKBIA基因结合，并且下调了这两个蛋白的表达。通过对SOCS1和NF-κB的敲低和过表达发现，SOCS1和NFKBIA可以在PEDV感染时抑制NF-κB通路，进一步探明miR-221-5p通过下调这两个负调控因子来激活NF-κB通路。 4.miR-615通过靶向IRAK1调控Ⅲ型干扰素（IFN-Ⅲ）的表达来促进病毒复制 （1）高通量测序的数据显示，在PEDV感染的SIEC细胞中miR-615下调。过表达miR-615可以促进PEDV在SIEC细胞中的复制，而敲低miR-615可以抑制PEDV在SIEC细胞中的复制。 （2）过表达miR-615，Ⅰ型干扰素和Ⅲ型干扰素都被下调，其中，IFN-λ1和IFN-λ3下调更明显。 （3）用miRanda、RNAhybrid和PITA3个数据库的预测miR-615的靶基因发现，IRAK1是miR-615的靶基因。双荧光素酶报告基因试验证明miR-615可以结合IRAK1靶基因区域。敲低IRAK1后，IFN-λ1和IFN-λ3的表达下降；过表达IRAK1后，IFN-λ1和IFN-λ3转录水平表达上调。并且，miR-615可以下调IRAK1的蛋白水平。将miR-615与IRAK1共转染，结果显示，IRAK1逆转了miR-615转染引起的IFN-λ1和IFN-λ3的下调和病毒复制的增加。 综上所述，分离到了一株PEDV毒株；PEDV感染SIEC的过程中改变了miRNAs的表达谱。miR-221-5p通过调控IκB和SOCS1蛋白激活了NF-κB通路，从而抑制PEDV复制；miR-615通过调控IRAK1抑制了NF-κB的激活，从而促进PEDV的复制，说明NF-κB通路在PEDV感染过程中起了重要作用。本研究揭示了miRNAs可以通过调控天然免疫通路来影响PEDV复制，为阐明PEDV致病机理提供了新的科学资料。

目录

缩略词表（Abbreviation Index）

文献综述

1.1 PEDV病原学特点

1.2 PEDV流行病学

1.3 PEDV的抗原突变

1.4 PEDV的致病性

1.5 PEDV与天然免疫

1.6 PEDV的分离鉴定

第二章 microRNAs研究进展

2.1 miRNAs概述

2.2 miRNAs的生物合成

2.3 miRNAs与mRNA

2.4 miRNAs与病毒感染之间的调控

2.5 miRNAs调控干扰素介导的抗病毒活性

2.6 miRNAs通过TLRs调控病毒复制

试验研究

3.1 材料

3.2 病毒的分离

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 PEDV感染的猪小肠上皮细胞miRNA组学分析

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 miR-221-5p对猪流行性腹泻病毒复制的影响及机制

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 miR-615对猪流行性腹泻病毒复制的影响及机制

6.1 材料

6.2 方法

6.3 结果

6.4 讨论

6.5 小结

结论

本论文的创新点

参考文献

致谢

作者简介