能源作物柳枝稷体外花器官逆转鉴定分析及相关基因功能研究

摘要

植物发育到一定的时期时，在合适的内部及外界因素的共同作用下，其个体将由营养生长转变为生殖生长。农业生产中，正常开花是以种子和果实为收获对象的农作物获得高产的重要前提。一般情况下，植物花器官发育是一个不可逆的过程，然而一些植物在特殊的自身条件和环境条件影响下，已形成的花器官会再次进入营养生长状态，从而发生花器官逆转。 柳枝稷（Panicum virgatum L.）是一种高大型禾草植物，具有耐旱、耐瘠薄、易于管理、生物质产量高等特点，在国际上被认定为模式能源作物。本研究发现，伸长期第4期的柳枝稷材料‘Alamo’的茎端已发育出长为1cm左右的幼穗，以该时期茎端为外植体进行体外培养发生了花器官逆转，通过解剖学、组织学及细胞学分析对此进行了证实，之后通过转录组技术获得了可能参与到花器官逆转中的基因，并对其中部分基因的功能进行了生物学验证。主要研究结果如下： 1.柳枝稷茎端在穗芽诱导培养基（MS+3mg.L-16-BA）上形成了不同类型的再生芽。通过对再生芽形态及分布特征分析发现，第一类再生芽由外植体节上所携带的腋芽发育而来，第二类再生芽由外植体节上诱导出的愈伤组织分化而来，第三类再生芽由柳枝稷幼穗上的小花原基发育而来。通过对第三类再生芽及其相邻的未完全逆转小花和正常小花进行组织切片观察发现，第三类再生芽中原本应发育成花器官的组织已退化，其生长点处形成凸起，重新进入了营养生长，而与其相邻的未完全逆转小花中虽有内外稃及雄蕊存在，但中心位置无胚珠结构，而是形成了球状营养器官。这些结果表明第三类再生芽是由小花生长点发育模式转变而来，而非小花中形成的不定芽，即柳枝稷幼穗诱导产生的再生芽来自花器官逆转。 2.对穗芽诱导培养基上诱导出的柳枝稷花逆转材料和MS培养基上诱导出的体外花发育材料以及未培养的幼穗进行转录组分析，根据不同材料所处的发育时期及不同的发育方向推测认为，花逆转材料与另两组材料相比均存在表达量差异而另两组材料相比无表达量差异的基因可能参与到花器官逆转。通过该方法共筛选出517个基因，经多个数据库注释分析发现，柳枝稷体外花器官逆转与细胞信号传导、能量代谢、蛋白转录后调控等多个生物学进程相关。此外，通过将筛选获得的517个基因与花发育相关基因对比发现，其中不存在已发表的影响花发育的基因，该结果表明花器官逆转与花发育存在着一定的差异性。然而通过对柳枝稷中花发育相关基因的表达水平分析发现，开花促进基因AP1在花逆转材料中表达水平下降，开花抑制基因TEM1/TEM2在花逆转材料中表达水平升高，但其变化幅度在两组对比中未全部达到2倍，该结果表明花器官逆转与花发育同样存在一定的联系。 3.通过过量表达4个在花器官逆转材料中高水平表达的基因发现，转基因拟南芥植株表现出叶面积增大或花期延迟或花器官发育不正常的现象，然而其均为表现出完整的花器官逆转现象。对该现象分析发现，花器官逆转可能涉及到抑制花器官发育、花器官分生组织发育模式转变及营养生长的促进等多个进程，单个基因过量表达可能只参与到了其中的一个过程，而花器官逆转是这些进程共同作用的结果，要获得完整的花器官逆转需要对更多基因同时进行表达调控。 4.PvSTK1基因编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，亚细胞定位分析发现该蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中均有分布。过表达PvSTK1基因使拟南芥（Arabidopsis thaliana）花期推迟，基部小花不育。通过对花发育相关基因的表达量分析发现，转基因植株中开花促进基因AP1、AG、FT及LFY的表达量降低，而开花抑制基因FLC和SVP的表达量升高，这表明PvSTK1基因影响到了光周期、春化及自主途径等多个花发育调控网络，且处于这些调控网络的上游。对转基因植株中花序基部不育小花分析发现，其花粉活力正常，然而胚珠在开花后逐渐萎缩。使用野生型拟南芥花粉进行授粉发现，花序基部不育小花仍保持不育，表明PvSTK1基因通过影响胚珠来使拟南芥小花不育。 本研究首次在柳枝稷中发现了并证实了体外花器官逆转现象，通过转录组分析较为全面地研究了可能参与到花器官逆转调控中的517个基因，并对部分基因的生物学功能进行了研究，从新的角度研究了植物营养生长与生殖生长的发育调控，为柳枝稷及其他植物花发育调控研究提供了新的基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 植物花器官发育研究现状

1.2 植物花器官逆转及研究进展

1.3 柳枝稷的研究与利用现状

1.4 转录组技术在功能基因挖掘中的应用

1.5 本研究的目的、意义及技术路线

第二章 柳枝稷体外花器官逆转诱导及鉴定

引言

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论与结论

第三章 利用RNA-seq研究柳枝稷体外花器官逆转相关基因

引言

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论与结论

第四章 柳枝稷花逆转相关基因PvSTK1的功能研究

引言

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论与结论

第五章 结论

附录

参考文献

致谢

个人简历