基于CRISPR/Cas9技术的奶山羊SCD1基因敲除及功能研究

摘要

硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase1，SCD1）是哺乳动物体内将饱和脂肪酸催化生成不饱和脂肪酸的关键酶，可以催化硬脂酸与棕榈酸生成油酸与棕榈油酸，这些不饱和脂肪酸是参与体内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇合成等重要生理代谢过程的关键因子。反刍动物乳腺组织作为不饱和脂肪酸生物合成的重要部位，脂肪酸代谢过程是影响乳品质的关键因素。利用有效技术手段探究SCD1在乳腺脂肪酸代谢中的功能对阐明羊奶脂肪酸代谢机理，提高羊奶品质与营养价值具有重要意义。 近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术以其高效率，低成本，简单易行等诸多优势，在家畜遗传改良方面逐步得到应用。本研究首先设计SCD1基因sgRNA，在山羊乳腺上皮细胞中筛选到效率较高的sgRNA，利用非同源末端连接修复（NHEJ）和同源导向修复（HDR）两种DNA修复机制，在山羊乳腺上皮细胞中敲除SCD1基因，构建SCD1基因敲除乳腺上皮细胞模型，探究SCD1基因敲除对乳腺脂肪酸代谢的影响作用，在小鼠受精卵和山羊孤雌激活胚胎敲除SCD1基因，得到两个物种胚胎水平的效率较高的sgRNA，并探究SCD1基因敲除对早期胚胎发育的影响。本研究的主要结果如下： 1.山羊SCD1基因sgRNA设计与筛选。利用不同浓度的嘌呤霉素处理乳腺上皮细胞，得到适于乳腺上皮细胞的嘌呤霉素48h最小致死浓度为1.0μg/mL。针对山羊SCD1基因第二外显子，设计3个sgRNA，构建sgRNA与Cas9的共表达载体，嘌呤霉素筛选后检测3个sgRNA在乳腺上皮细胞的基因编辑效率分别为sgRNA18.3%，sgRNA2未检测到，sgRNA319.4%，测序结果显示在sgRNA靶位点处存在多种碱基缺失和突变情况。 2.HDR途径同源重组载体的构建。克隆得到SCD1基因位点效率较高的sgRNA3上下游DNA序列作为同源重组载体的同源臂，长度分别为1193bp和1063bp，同源臂连接到嘌呤霉素与绿色荧光蛋白序列上下游，成功构建同源重组载体5?arm+EGFP+PURO+3?arm，并构建无抗性无荧光标记的PX330-sgRNA3表达载体。 3.SCD1基因敲除单克隆细胞筛选及脱靶位点分析。在非同源末端连接修复（NHEJ）途径中转染含嘌呤霉素抗性的sgRNA3/Cas9表达载体，筛选后获得SCD1单等位基因敲除的乳腺上皮细胞，单克隆细胞基因组序列为SCD1基因的单等位基因第二外显子存在24个碱基缺失和1个碱基突变；在同源导向修复（HDR）途径中，将无抗性与荧光标记的PX330-sgRNA3与同源重组载体共同转染细胞，筛选获得SCD1单等位基因敲除乳腺上皮细胞，单克隆细胞基因组序列为SCD1单等位基因的第二外显子插入puromycin与EGFP的表达框。预测山羊基因组上sgRNA3的10个脱靶位点，在两种途径获得的SCD1基因敲除细胞中均没有发现脱靶现象。 4.SCD1单等位基因敲除对乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响。检测两种途径获得的SCD1单等位基因敲除的乳腺上皮细胞SCD1表达水平，mRNA表达下调80%，蛋白表达下调50%，并可显著降低细胞中甘油三酯、胆固醇的含量（P<0.05），同时C16:1、C18:1含量及去饱和指数也显著下调（P<0.05），两种途径敲除细胞中FASN，FABP3，FABP4表达量显著下调（P<0.05），HDR途径获得的细胞中显著上调DGAT2表达（P<0.05），在NHEJ途径中有上调趋势但不显著，在两种途径中转录因子SREBP1mRNA和蛋白水平均显著下调（P<0.05）。 5.小鼠胚胎SCD1基因敲除研究。针对小鼠SCD1基因第一和第二外显子，设计5个sgRNA，体外转录得到sgRNA与Cas9mRNA，体外切割试验检测到其中4个sgRNA具有体外切割活性，将sgRNA与Cas9mRNA混合注射小鼠受精卵，得到小鼠受精卵SCD1基因sgRNA打靶效率分别为9.1%，37.9%，48.1%和20.0%，且SCD1基因敲除对小鼠胚胎早期发育具有抑制作用（P<0.01），降低了发育到桑椹胚和囊胚的胚胎比例。 6.山羊孤雌激活胚胎SCD1基因敲除研究。针对山羊SCD1基因第一、二、三、四外显子及功能域序列设计7个sgRNA，首先在乳腺上皮细胞验证sgRNA的编辑效率，分别为19.4%，34.7%，29.3%，44.6%，16.2%，22.4%，46.2%，体外切割试验表明6个sgRNA具有体外切割活性，在山羊孤雌激活胚胎的编辑效率分别为7.1%，未检测到，14.3%，4.5%，未检测到，35.9%和9.1%，且SCD1基因敲除后不影响孤雌激活胚胎卵裂率（P>0.05）。 本研究利用CRISPR/Cas9技术，通过NHEJ与HDR两种DNA修复途径，获得SCD1单等位基因敲除乳腺上皮细胞，证明SCD1基因在乳腺上皮细胞单不饱和脂肪酸合成过程中的重要作用。通过CRISPR/Cas9技术介导的基因组编辑，获得SCD1基因敲除小鼠受精卵和山羊孤雌激活胚胎，为生产基因编辑动物提供技术支持与理论依据。本研究为阐明羊奶不饱和脂肪酸合成机制奠定理论基础，为SCD1基因敲除小鼠和奶山羊制备提供技术支持。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 文献综述

1.1羊奶脂肪酸的营养价值

1.2乳腺脂肪酸合成代谢调控

1.3 SCD1基因研究进展

1.4 CRISPR/Cas9基因编辑系统概述

1.5 CRISPR/Cas9系统的应用

1.6 CRISPR/Cas9系统在转基因动物生产中的应用

1.7 研究的目的与意义

第二章 山羊SCD1基因sgRNA设计筛选与同源重组载体构建

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 基于非同源末端连接修复（NHEJ）和同源导向修复（HDR）机制的SCD1基因敲除乳腺上皮细胞的制备

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 山羊乳腺上皮细胞SCD1基因敲除对脂肪酸代谢的影响研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 小鼠受精卵SCD1基因敲除研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

第六章 山羊孤雌激活胚胎SCD1基因敲除研究

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

6.4 小结

结论

创新点

存在问题及展望

参考文献

附录

致谢

个人简历