ASPCR检测HIV-1微量耐药突变方法的建立和初步应用

摘要

在艾滋病抗病毒治疗前期或治疗过程中及时了解HIV耐药毒株存在和发生情况，对抗病毒治疗方案的制定具有很好的指导作用。检测劣势耐药毒株可以更好地了解耐药性产生的机理并及时地指导临床抗病毒治疗，尽可能延缓病人耐药的出现。目前常用的HIV耐药检测方法是以测序为基础的基因型分析方法，如In-house法和VimSeq基因型耐药检测系统。这些方法在耐药毒株占病毒准种的20％～30%以上时才能检出，不能检出微量耐药突变，不能满足临床早期诊断耐药及研究耐药进化路径的需要。相对于基因型分析方法，Allele-specific real-timePCR(ASPCR)方法能够高效检出微量(0.01%～1%)耐药病毒准种。本研究针对我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中最常见的K103N、M184I/M184V、T215F/T215Y耐药突变位点，建立了ASPCR检测耐药突变的方法，验证了这个方法的特异性、灵敏度、准确性和重复性。使用建立的ASPCR方法对76例接受抗病毒治疗的艾滋病患者进行了耐药突变毒株检测及其占病毒准种比例的分析，并对10例艾滋病患者的系列样本（共64份）进行了5个耐药突变发生发展的监测。
　　 第一部分 ASPCR方法的建立及验证
　　 建立了ASPCR检测5个常见耐药突变的方法，包括：(1)设计并制备主要试验材料。以HIV-1 pNL4-3质粒为模板，分别扩增两端都带有酶切位点的并且含103、184、215位点的DNA片段，将其连接到T载体，进行定点诱变并转化测序，得到含K103N、M1841/M184V、T215F/T215Y耐药突变的质粒作为标准品。设计特异性和非特异性的引物用以区分野生型和突变型质粒。制定SYBR green荧光法进行实时定量PCR，检测上述耐药突变的流程和结果判定标准。(2)对建立的ASPCR方法检测各个突变位点的特异性、灵敏度、准确度、重复性等进行验证，包括用构建的含有耐药突变的质粒进行的验证、用传统基因型方法检测存在相应耐药突变的样本和野生型病毒培养上清进行的验证和构建并包装含有突变的病毒及在病毒水平上的验证。在病毒水平上的验证，做法是，将经过测序鉴定的带有突变位点的片段从T载体上双酶切下来，并与经过处理的pNL4-3的骨架进行连接，然后转染293T田胞，得到了野生型病毒和含相应耐药突变位点的假病毒。测定含有K103N、K103K和M184I（本室保存）的包装病毒的病毒载量，将含耐药突变的病毒与野生型病毒根据载量按比例混合，提取混合病毒的RNA，进行一步法逆转录，对稀释后的第一轮PCR产物进行实时定量检测，在病毒水平上验证方法的准确性和灵敏度。主要结果如下：
　　 1、建立了ASPCR检测5个常见HIV-1耐药突变(K103N、M184I/M184V、T215F/T215Y)的方法，构建了5个耐药突变的标准质粒、设计了特异性和非特异性引物、制定出检测流程和结果判定标准。用这个方法能够准确地检测出标本中是否含有某种耐药基因突变及携带耐药突变的毒株占病毒准种的比例。
　　 2、ASPCR标准品制备良好，标准曲线的相关系数I2均大于0.99，能够准确反映模板量和C值间的线性关系，可以用于待测样本的定量。
　　 3、各个突变位点的特异引物对野生型和突变型模板具有良好的分辨力、准确性和重复性，批次间和同批次内的变异系数均低于0.42。
　　 4、质粒水平验证结果显示，ASPCR检测K103N、T215F、T215Y的灵敏度可达0.04%，0.03%和0.02%；检测M184V和M184I的灵敏度可达0.4%和03%。
　　 5、在病毒水平验证结果显示，ASPCR检测NNRTIs类耐药位点K103N的灵敏度可达0.02%左右，检测NRTIs类耐药位点M1841的灵敏度可达大0.01%。且混合病毒的ASPCR测定比例与理论比例具有良好的一致性。因此，ASPCR方法的前期流程(RN刖是取、逆转录、第一轮普通PCR)对方法的灵敏度、准确性无明显影响。
　　 6、建立的ASPCR方法对阴阳性对照样本具有良好的检测能力，K103N、M1841、M184V、T215F和T215Y的ACt临界值分别为12.5、8.0、9.7、16和12，可以用于对实际样本的检测。
　　 第二部分ASP CR方法在检测HⅣ．1微量耐药突变中的应用
　　 利用建立的ASPCR方法对临床样本进行了相应耐药位点的检测。对76份血浆样本分别进行了K103N、MI84I/M184V、T215F/T215Y横断面检测，检测了10例（64人份）我国河南省某县最早接受抗病毒治疗（治疗时间为2003年11月）病人的系列样本，绘制了相应的耐药位点的变化曲线，监测其耐药突变变化的情况，并将ASPCR检测5个耐药突变位点的结果与常规基因型耐药检测方法进行了比较。主要结果如下：
　　 1.140份样本中，62份存在K103N、46份存在T215F、85份存在T215Y、73份存在M184I、89份存在M184V。ASPCR方法检出的耐药突变中，大多数占病毒准种的比例低于10%或高于50%，其中一半以上耐药突变占病毒准种的比例低于20%。
　　 2.与常规HIV-1基因型耐药检测方法相比，ASPCR检测微量耐药突变的能力显著提高。在5个耐药突变位点中，除K103N位点外，ASPCR与常规基因型分析方法的检测结果在统计学上存在显著差异(K103N:33.6% vs37.1%(P=0.5320):M184V:17.1% vs63.6%( p<0.0001);M184I:7.1% vs52.1%(p<0.0001);T215Y:38.6%vs60.7%(p=0.0002)和T215F:10.0%、vS32.9%(p<0.0001)).ASPCR可以检测出占病毒准种20%以下的微量突变，而常规基因型分析方法通常仅能检出20%以上的耐药突变。
　　 3.用ASPCR方法检测76份横断面调查的患者样本，检出K103N、M184I/V、T215F/Y耐药突变的患者占患者总数的比例分别为5132%、73.68%、5921%。携带NRTIs类耐药突变(M184I/V、T215F/Y)的病人的分布比例高于携带NNRTIs类耐药突变(K103N)的病人的分布比例(p=0.0159<0.05)。M184I与M184V在患者中的分布情况基本一致，而T215F与T215Y却呈现此消彼长的分布趋势，即病毒准种中如T215F占的比例较高，则T215Y占的比例就低，反之亦然。
　　 4.横断面调查样本的ASPCR检测结果显示，病毒载量高（>10000 copies/ml）的患者中，50%以上的K103N、M184I/V耐药突变毒株为微量耐药突变（占病毒准种的比例低于20%）；而T215F/Y毒株在病毒准种中所占的比例与病毒载量的高低一致，即较高比例（大于50%）的T215F/Y主要分布在病毒载量高(>10000copies/ml)的样本中，微量（占病毒准种的比例低于20%）T215F/Y主要存在于相对低病毒载量《<10000 copies/ml)样本中。在病毒载量相对较低(<10000copies/ml)的人群中，42%左右的KI03N毒株占到病毒准种的50%以上。
　　 5.用ASPCR方法检测系列样本的耐药突变，结果表明，通常K103N耐药突变出现的较早，T215Y一般在抗逆转录病毒治疗后一年半左右出现并长期稳定地保持较高比例（大于20%）。在药物治疗人约3年后耐药突变情况发展得比较复杂，出现较多的耐药突变。
　　 6.首次在我国建立了检测HIV-1微量耐药突变的ASPCR方法，通过对部分样本的检测，分析了部分艾滋病患者的5个耐药突变准种的定量分布和动态变化情况。对抗病毒治疗和阐明病毒进化耐药发生具有重要作用。