ELISPOT和IP-10检测用于结核病诊断的研究

摘要

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的可侵犯全身多系统多器官的疾病。近年来,由于HIV感染流行、耐药结核的产生、人口流动和免疫抑制剂的应用增多等原因,全球结核病疫情进一步加重,每年约有800万新发结核病患者,有300万人死于结核病,结核病是引起死亡的第二大感染性疾病。我国现有活动性肺结核病人约500万,每年约有13万人死于结核病。结核病的诊断金标准是在痰、体液和/或病理样本中找到结核分枝杆菌。痰菌阳性的肺结核病人是结核病的主要传染源,但活动性肺结核病人中约有74％表现为痰菌阴性,缺乏诊断的金指标,容易与肺部常见疾病(如细菌性肺炎和支气管肺癌)混淆。结核性脑膜炎属于重症结核,能否早期诊治对其预后意义重大,但临床上,能从细菌学或病理学上确诊结核性脑膜炎(TBM)的可能性低下,诊断困难。误诊或诊断延迟不仅造成个体预后不佳,同时增加群体结核病患病的压力。
　　机体感染结核分枝杆菌后,体内产生记忆性的T淋巴细胞(主要是Th1细胞),再次接触结核杆菌特异性抗原时产生和分泌IFN-γ。酶联免疫斑点法(ELISPOT)是一种IFN-γ释放试验(IGRA),其较为成熟的方法是T-SPOT.TB试验,试剂盒已被美国FDA批准应用于临床,CDC为其制定了使用指南。ELISPOT通过计数有效释放IFN-γ的细胞,可以发现Mtb的潜伏感染、辅助诊断活动性结核病。应用结核分枝杆菌所特有的ESAT-6、CFP-10作为刺激抗原,不受卡介苗和非结核分枝杆(NTM)菌感染的影响,因此许多实验证明ELISPOT不仅能够证实结核分枝杆菌感染的存在,而且对肺结核诊断具有较高的特异性和一定的敏感性。研究显示结核抗原特异性T细胞有向病变部位集中的特点,感染局部的体液中可能存在比较多的结核分枝杆菌特异性细胞,因此我们推测,应用ELISPOT方法检测脑脊液,将提高结核性脑膜炎的诊断效率。本研究通过ELISPOT检测脑脊液和血中分泌IFN-γ的细胞数,并与抗酸杆菌涂片、分枝杆菌培养、荧光定量PCR、结核抗体检测等临床检验结果进行比较,结果表明ELISPOT检测脑脊液细胞具有较高的敏感性和特异性,联合检测血和脑脊液ELISOPT能够提高诊断效率,可以作为结核性脑膜炎的辅助诊断方法,为结核性脑膜炎的早期诊断治疗提供依据。
　　IP-10是由IFN-γ或脂多糖诱导产生的一种趋化因子,属于趋化因子CXC亚家族,在炎症部位对淋巴细胞的活化和趋化起重要作用。IP-10的表达与IFN-γ的水平密切相关,作为IFN-γ诱导产生的下游趋化因子,能够显著地扩大IFN-γ的信号功能,有研究发现结核分枝杆菌特异性肽融合抗原刺激肺结核患者的PBMCs能够诱导产生高浓度的IP-10。Ruhwald等人报道联合检测IP-10等因子,能够提高干扰素释放试验的敏感性。本研究用结核分枝杆菌特异性抗原肽(ESAT-6、CFP-10)刺激活动性肺结核和肺部常见疾病(细菌性肺炎和支气管肺癌)患者外周血单个核细胞,检测结核分枝杆菌抗原特异反应性IP-10水平,结果提示联合检测结核分枝杆菌抗原特异反应性IP-10和IFN-γ,能够显著提高结核病诊断敏感性和特异性,可以作为肺结核的一种辅助诊断方法。
　　目的:
　　研究IFN-γ释放试验(ELISPOT方法)对结核性脑膜炎的诊断价值;研究结核分枝杆菌抗原特异反应性IP-10和IFN-γ对肺结核的诊断价值。
　　方法:
　　1.利用ELISPOT检测脑膜炎患者脑脊液和血中Mtb抗原特异性的IFN-γ分泌细胞数量。
　　2.采用FlowCytomix流式技术检测肺结核和其他常见肺部疾病患者的PBMCs培养上清中特异性抗原反应性IP-10和IFN-γ的浓度。
　　3.收集并记录脑脊液抗酸染色涂片、分枝杆菌培养、荧光定量PCR、结核抗体检测的结果。
　　结果:
　　1.脑脊液ELISPOT检测的敏感度为67.3%,特异度为89.2%,符合率为73.3%,PV+值为94.3%,对结核性脑膜炎具有较高的临床诊断价值。
　　2.血ELISPOT检测的敏感度为85.9%,特异度为41.9%,符合率为74.1%,PV+值为80.2%。比较血和脑脊液ELISPOT检测结果,发现血液检测特异度较低,考虑与非结脑患者合并脑外结核相关。
　　3.联合检测脑脊液和外周血T-SPOT.TB敏感性为91.1%,特异性96.4%。
　　4.分别比较脑脊液ELISPOT检测与结核抗体、荧光定量PCR、抗酸杆菌染色和分枝杆菌培养检测的结果,结果表明脑脊液ELISPOT检测敏感性显著高于其他检测(P<0.05)。
　　5.采用FlowCytomix技术检测外周血PBMCs培养上清中的IP-10和IFN-γ的浓度,结果表明肺结核组显著高于正常对照组和常见肺病组。
　　6.肺结核患者PBMCs经结核抗原刺激后IP-10和IFN-γ浓度呈正相关;联合检测IP-10和IFN-γ能够显著提高诊断肺结核的敏感性和特异性。
　　结论:
　　1.脑脊液ELISPOT检测在结核性脑膜炎诊断具有较高的敏感性和特异性,可以作为结核性脑膜炎的辅助诊断,有利于早期诊断结核性脑膜炎。联合脑脊液与血的ELISPOT检测能提高结核性脑膜炎诊断的敏感性和特异性。
　　2.联合检测结核分枝杆菌抗原特异反应性IP-10和IFN-γ,能够显著提高肺结核诊断的敏感性和特异性。

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中文摘要

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前言

一、结核病的诊断现状

二、结核病的实验室诊断

三、 本课题研究内容

第一部分ELISPOT检测对结核性脑膜炎的诊断意义

1 材料与方法

1.1.1 研究对象

1.1.2 仪器

1.1.3 试剂

1.2.1 收集样本

1.2.2 试剂的配制

1.2.3 PBMCs的分离提取与计数

1.2.4 ELISPOT的检测

1.2.5 收集样本资料

1.2.6 统计学分析

2. 结果

2.1 ELISPOT斑点计数和结果判定

2.2 不同方法的阳性率比较

2.3 脑脊液T-SPOT.TB检测结果

2.4 血T-SPOT.TB检测结果

2.5 脑脊液与血T-SPOT.TB的检测结果比较

2.6脑脊液T-SPOT.TB检测与脑脊液结核菌PCR检测结果比较

2.7 脑脊液T-SPOT.TB检测与结核抗体结果比较

2.8 未合并脑外结核组的检测结果

2.9 6种方法均有检测的结果比较

3 讨论

第二部分结核病患者结核分枝杆菌特异性抗原反应性IP-10的表达特点及诊断意义

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果

2.1 肺结核患者PBMCs经结核特异抗原刺激后分泌IP-10显著高于正常对照组及常见肺病组

2.2 肺结核患者PBMCs经结核特异抗原刺激后分泌IFN-γ显著高于正常对照组及常见肺病组

2.3 肺结核患者PBMCs经结核分枝杆菌抗原肽刺激后分泌IP-10和IFN-γ的相关性

2.4 IP-10和IFN-γ的鉴别诊断价值

3.讨论

总 结

参考文献

文献综述

发表论文

个人简历

致谢