ELISPOT检测1型糖尿病GAD65特异性T细胞的方法学研究

摘要

第一部分 IL-2和IL-7对1型糖尿病患者GAD65特异性T细胞反应影响的比较
　　目的:明确何种细胞因子及其最佳浓度（IL-2或IL-7）能够最大程度地改善酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测1型糖尿病谷氨酸脱羧酶65（GAD65）特异性T细胞反应的信噪比。
　　方法:选取1型糖尿病(T1DM)患者41例，年龄和性别均匹配的健康对照28例;Ficoll法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，以人GAD65、内对照、Pediacel（巴斯德五合一疫苗）为抗原，加入不同浓度的IL-2（0U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL和12.5U/mL），ELISPOT检测上述各孔分泌IFN-γ的CD4+T细胞，比较各浓度组的GAD65孔（信号）、内对照孔（背景）的斑点数、斑点净值以及刺激指数（即信噪比，SI），获得最佳浓度后再进一步与IL-7(0.5ng/mL)进行上述指标的比较。
　　结果:1）T1DM患者在加入IL-2刺激后，各浓度组中GAD65反应性T细胞数均较无IL-2组增高，而各浓度下的内对照孔的斑点数（即背景）亦成比例升高。各浓度组斑点净值比较显示，12.5与2.5U/mL组无统计学差异，而刺激指数(SI)的比较则提示，2.5U/mL组最高，即可以最大程度地提高信噪比;且仅在该浓度下，T1DM患者的刺激指数(2.8)高于健康对照(1.5)，差异有统计学意义(P＜0.05)。2) IL-7组的GAD65孔斑点数均略高于IL-2，但IL-7组的背景的增幅更高，但差异无统计学意义。而平均斑点净值和SI的比较则显示，IL-2组在T1DM患者均显著高于IL-7组（斑点净值:5.5 vs4.3;刺激指数:2.8 vs1.8，P均＜0.05）。
　　结论:1）IL-2在2.5U/mL浓度下为ELISPOT检测1型糖尿病患者GAD65特异性T细胞反应的最佳浓度;2）IL-2较IL-7更有利于改善ELISPOT检测的信噪比。
　　第二部分不同冻存方法对1型糖尿病胰岛GAD65抗原特异性T细胞反应的影响
　　目的:明确何种冻存方法（低温冻存或室温冻存）更有利于保存1型糖尿病患者(T1DM)的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)对胰岛抗原特异性的T细胞反应，使其更接近于新鲜细胞的反应状态。
　　方法:选取T1DM患者9例，年龄和性别匹配的健康对照(Healthy Control)9例，将其分离的PBMCs分为三份，一份行亚型细胞的流式细胞分析(FACS)和ELISPOT实验，另两等份分别采用IDS-TCW推荐的低温和室温冻存方案冻存。一个月后分别按低温和室温复苏方案复苏细胞，台盼蓝染色评价细胞活力;亦行FACS细胞亚群分析和ELISPOT检测。ELISPOT中四种抗原为人GAD65、内对照、Pediacel（巴斯德五合一疫苗）和PMA。以新鲜细胞为标准，比较两种冻存方法中的细胞复苏率和活力、PBMCs亚群细胞比例和ELISPOT中分泌IFN-γ的CD4+T细胞斑点数及刺激指数。
　　结果:1）T1DM患者和健康对照在室温冻存下的细胞复苏率及活力均略优于低温冻存细胞，但二者间的差异无统计学意义;2）FACS检测显示，低温和室温冻存复苏后的PBMCs中单核细胞所占比例均较新鲜细胞降低(P＜0.05)[3.2±1.1％（低温）和3.0±0.9％（室温）vs7.0±1.1％（新鲜）;P＜0.05];但CD4+T和CD8+T细胞、B细胞、NK及NKT细胞的比例在三种状态下均无统计学差异。3）在ELISPOT检测中除PHA以外，记忆性抗原和胰岛特异性抗原刺激的T细胞反应在冻存细胞均低于新鲜细胞，且两种冻存方案间无统计学差异;T1DM患者新鲜细胞的GAD特异性T细胞反应的SI为5.3，均高于低温(1.1)和室温(1.5)冻存复苏细胞的SI（均P＜0.05）;而且仅在新鲜细胞，可以探测到T1D患者较健康对照增多的GAD反应性T细胞斑点数和SI（8.6 vs0.3和5.3 vs1.1，均P＜0.05），而两种冻存方案下细胞均未检测到这种差异。
　　结论:现有的两种冻存方案暂时均不足以维持我们目前开展的ELISPOT检测1型糖尿病的CD4+T细胞反应，需进一步探讨更优的冻存方案。

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摘要

缩略语

第一章 前言

第一部分 IL-2和IL-7对1型糖尿病GAD65特异性T细胞反应影响的比较

对象与方法

1 研究对象

2 研究方法

3 统计学分析

结果

讨论

第二部分 不同冻存方法对1型糖尿病GAD抗原特异性T细胞反应的影响

对象与方法

1 研究对象

2 研究方法

3 统计学分析

结果

讨论

全文结论

参考文献

综述 ELISPOT技术在1型糖尿病中的应用及其标准化进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢