单壁碳纳米管暴露致肺免疫毒性介导凝血纤溶系统改变的间接毒性作用研究

摘要

纳米材料具有特殊的物理、化学性质，因而被广泛应用于医药、电子、化工、环保等诸多领域。进入环境的纳米材料正在成为一类新型污染物，对人类的健康构成现实威胁。目前，很多国家就纳米材料安全性问题，展开了多种项目和计划，其目的是控制纳米技术的风险性。开展纳米材料生物安全性的基础研究，建立纳米材料生物安全性评价的关键技术，是促进纳米材料合理利用的必然要求，具有重大科学意义和社会效益。纳米材料进入人体的主要途径之一是呼吸道的暴露。大量流行病学及实验研究证明，吸入污染空气中的颗粒物可导致心血管疾病发病率和死亡率增加。其中，纳米颗粒物即超细颗粒物，可能在大气颗粒物诱发心血管疾病方面起主要作用。到目前为止，依然缺乏有关纳米颗粒物经呼吸道吸入后诱发心血管毒性效应的系统性研究资料，其背后可能的作用机制仍未完全阐明。作为一种典型的纳米材料，单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotube，SWCNT)已经成为纳米科技发展中应用最广泛的材料之一。现有的关于SWCNT的毒性研究，多数集中在SWCNT对组织、脏器及细胞造成的直接损伤方面，对SWCNT通过影响呼吸系统免疫毒性而发挥间接的心血管毒性效应尚未进行深入的研究。
　　目的：
　　1.研究SWCNT经呼吸道暴露后，机体凝血纤溶系统包括脉管系统的变化，阐明该变化与肺脏出现的免疫毒性反应之间的关联性。
　　2.探讨SWCNT暴露致肺免疫毒性在介导凝血纤溶系统改变中的间接毒性作用及可能的作用机制。
　　方法：
　　在整体动物实验中，选取雄性Wistar大鼠采用非暴露式气管滴注方式染毒，隔日染毒一次，分别暴露30天和60天。HE染色法观察各组大鼠肺组织病理学变化;ELISA法检测大鼠肺组织、血浆中几种炎性因子表达水平，包括白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。同时检测血浆中凝血纤溶相关因子的变化，包括:组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原活化剂抑制物-1（PAI-1）、D-二聚体(D-dimer)、内皮素(ET-1)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、一氧化氮(NO)以及血管性血友病因子(vWF)。透射电镜观察大鼠胸主动脉血管内膜的损伤情况;免疫组化法检测血管内皮相关因子的表达;RT-PCR法检测血液中mRNA的表达。
　　在体外细胞实验中，分别培养大鼠肺泡巨噬细胞株及原代大鼠主动脉血管内皮细胞，以肺泡巨噬细胞作为效应细胞，血管内皮细胞作为靶细胞，建立体外炎性因子刺激模型和细胞间接暴露模型。观察SWCNT染毒后细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞活性;ELISA法检测细胞培养液上清中炎性因子及凝血纤溶活化因子表达水平;流式细胞仪检测ROS水平的变化;Western blot检测血管内皮细胞相关蛋白的表达。
　　结果：
　　一、整体动物实验
　　1.肺免疫毒性损伤:SWCNT经呼吸道分别暴露30天和60天后，大鼠肺部出现病理性改变，局部可见不同程度的棕黑色颗粒物沉积、肺部间质性炎症;肺组织表达炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α水平与正常对照组相比显著增加，提示肺组织出现炎性免疫反应。
　　2.血液系统变化:
　　(1) SWCNT经呼吸道暴露30天和60天后，大鼠出现不同程度的全身系统性炎症，表现为血浆中炎性因子IL-1α、IL-6、TNF-α水平升高、白细胞(WBC)、血小板(PLT)释放增多;同时，血浆粘稠度升高、血中纤维蛋白原(FIB)含量增加。
　　(2)大鼠血浆中凝血纤溶活化因子测定结果显示，血管内皮细胞分泌、合成或释放AT-Ⅲ、t-PA、TM等因子减少，而合成vWF、TF、ET-1增多，提示血管内皮细胞发挥凝血和抗凝功能紊乱，甚至血管内皮损伤。
　　3.血管内皮系统的损伤:
　　(1) SWCNT暴露60天后，染毒组大鼠血管内膜层出现细胞核畸形、核质固缩等异常改变，结合病理检查发现染毒60天，高剂量组大鼠血管内皮细胞周围有炎细胞浸润，这些结果提示血管内膜受到刺激，并且发生不同程度的损伤。
　　(2) SWCNT暴露30天和60天后，血管内皮表达t-PA抗原明显降低，同时中、高剂量组大鼠血管内膜表达vWF显著升高，进一步表明并验证大鼠血管内皮细胞的抗血栓功能减弱、内皮细胞发生损伤。
　　4.外周血相关基因的表达:SWCNT暴露60天后，高剂量组大鼠外周血中t-PA基因表达明显降低而TM基因表达明显升高，提示它们可能成为SWCNT呼吸道暴露所致大鼠凝血纤溶功能紊乱较为敏感的生物标志基因。同时，高剂量组p38MAPK基因表达亦明显升高，提示p38MAPK信号转导途径可能是参与SWCNT所致机体凝血纤溶活化因子改变的主要作用机制之一。
　　二、体外细胞试验
　　1.SWCNT对大鼠肺泡巨噬细胞的影响:
　　(1)大鼠肺泡巨噬细胞经SWCNT暴露48 h，可见细胞吞噬纳米颗粒物质，胞浆内出现黑色颗粒，随着染毒剂量的增加，这种吞噬作用越发明显，表现为巨噬细胞聚集并吞噬纳米颗粒，当染毒剂量大于50μg/mL时，巨噬细胞聚集成团状，胞浆内几乎充满黑色纳米颗粒，当染毒剂量达到200μg/mL时，细胞死亡增加，细胞数量明显减少。
　　(2)随着SWCNT暴露剂量的增加和暴露时间的延长，肺泡巨噬细胞活性呈降低趋势。与正常对照组相比，SWCNT暴露24 h、48 h和72 h后，50，100，200μg/mL SWCNT染毒组的细胞活性明显降低，差异具有统计学意义。
　　(3)暴露于75μg/mL和100μg/mL的SWCNT染毒液96 h后，大鼠肺泡巨噬细胞活性氧水平高于正常对照组，其中，SWCNT100μg/mL组活性氧水平与对照组相比显著升高，差异具有统计学意义。该结果提示SWCNT可通过氧化应激方式，对大鼠肺泡巨噬细胞造成毒性损伤。
　　(4)大鼠肺泡巨噬细胞在SWCNT的刺激下，能够持续分泌前炎症因子IL-1α、IL-6以及TNF-α。随着暴露时间的延长和染毒剂量的增加，炎性因子IL-1α分泌水平呈增加趋势。与正常对照组相比，SWCNT50，75，100μg/mL染毒组分别暴露24h、48 h和96 h后，细胞分泌IL-1α水平均显著高于正常对照组;SWCNT50，75，100μg/mL染毒组分别暴露24 h和48 h后，细胞分泌IL-6水平均显著高于正常对照组;SWCNT75，100μg/mL染毒组分别暴露48h和96 h后，细胞分泌TNF-α水平均显著高于正常对照组，差异均具有统计学意义。
　　2.炎性因子对大鼠血管内皮细胞分泌凝血纤溶相关因子的影响:利用炎性因子TNF-α刺激大鼠血管内皮细胞后，内皮细胞分泌凝血纤溶相关因子发生改变，主要表现为AT-Ⅲ、t-PA分泌减少，vWF、TF、PAI-1释放增多，提示血管内皮细胞功能受到影响。
　　3.大鼠肺泡巨噬细胞介导的SWCNT间接暴露对大鼠血管内皮细胞功能的影响及相关信号转导通路:
　　(1)血管内皮细胞经间接暴露模型处理后，各组细胞分泌t-PA的水平均显著低于正常对照组和SWCNT直接暴露组;而各组细胞分泌PAI-1的水平虽与正常对照组相比显著升高，但与SWCNT直接暴露组相比，不具有显著性差异。SWCNT暴露剂量为100μg/mL时，经间接暴露模型处理的RAECs组分泌TF水平显著高于正常对照组和SWCNT直接暴露组。SWCNT暴露剂量为25和100μg/mL时，经间接暴露模型处理后的RAECs分泌AT-Ⅲ的水平与正常对照组和SWCNT直接暴露组相比，均显著降低。提示肺泡巨噬细胞对血管内皮细胞具有一定的介导作用，能够导致血管内皮细胞功能的变化。
　　(2) Western blot试验结果显示，经间接暴露模型处理后的各组血管内皮细胞表达t-PA蛋白的水平明显低于正常对照组，当SWCNT暴露剂量为75和100μg/mL时，内皮细胞表达JNK蛋白的水平显著高于正常对照组;当SWCNT暴露剂量为100μg/mL时，内皮细胞表达磷酸化和非磷酸化p38MAPK水平与正常对照组相比，均显著升高，差异具有统计学意义，提示p38MAPK途径和JNK途径可能是参与调控相关凝血因子的主要通路。
　　结论：
　　1.单壁碳纳米管经呼吸道暴露可导致大鼠肺脏免疫炎性反应和病理性改变，血管内皮损伤及机体凝血纤溶系统功能紊乱。
　　2.SWCNT对体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞具有毒性作用，诱导细胞内活性氧产生增加及持续分泌前炎症因子。而TNF-α可导致血管内皮细胞分泌凝血纤溶相关因子发生改变。
　　3.相对于SWCNT直接暴露而言，通过大鼠肺泡巨噬细胞介导的间接暴露在诱导血管内皮功能紊乱方面的作用可能更为显著。p38MAPK和JNK信号通路可能参与调控此间接毒性作用。这种间接毒性作用是区别于以往研究认为的纳米材料直接作用的一个重要发病机制。
　　4.肺免疫毒性在介导SWCNT所致机体凝血纤溶系统改变中发挥重要作用，其机制之一为:SWCNT通过导致大鼠肺泡巨噬细胞释放炎症因子，从而间接介导血管内皮功能障碍，进而使机体发生凝血纤溶相关活化因子的改变而引起凝血纤溶系统功能紊乱。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

1 国内外研究现状

2 立题依据

3 研究内容与拟解决的科学问题

3．1 研究内容

3．2 拟解决的科学问题

4 理论意义与实用价值

5 技术路线

第一章 单壁碳纳米管暴露整体动物实验

1 引言

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要试剂

2．3 主要实验仪器与耗材

3 实验方法

3．1 染毒悬液的制备与纳米材料表征

3．2 实验动物分组及染毒方法

3．3 炎性细胞因子的测定

3．4 组织病理学检测

3．5 SWCNT暴露致大鼠血液成分及血流变学相关指标的测定

3．6 大鼠血管内膜超微结构观察

3．7 大鼠血浆中凝血纤溶活化因子的测定

3．8 免疫组化分析血管内膜凝血纤溶相关因子的表达

3．9 大鼠外周血中相关基因的表达

3．10 统计学处理

4 实验结果

4．1 炎性细胞因子的测定结果

4．2 组织病理学检测结果

4．3 大鼠血液成分及血流变学相关指标测定结果

4．4 大鼠血管内膜超微结构观察

4．5 大鼠血浆中凝血纤溶活化因子的测定

4．6 凝血纤溶相关因子在血管内膜的表达

4．7 大鼠外周血中相关基因的表达

5 小结

6 讨论

7 附表

第二章 单壁碳纳米管对大鼠肺泡巨噬细胞的毒性效应

1 引言

2 实验材料

2．1 肺泡巨噬细胞株

2．2 主要试剂

2．3 主要实验仪器与耗材

3 实验方法

3．1 NR8383细胞培养方法

3．2 纳米颗粒悬液的配制与细胞染毒

3．3 细胞形态学观察

3．4 细胞活-性测定

3．5 活性氧族的测定

3．6 细胞分泌炎性因子的测定

3．7 统计学处理

4 实验结果

4．1 细胞形态学观察结果

4．2 细胞活性测定结果

4．3 细胞活性氧族测定结果

4．4 细胞炎性因子分泌结果

5 小结

6 讨论

7 附表

第三章 单壁碳纳米管呼吸道暴露导致机体凝血纤溶系统改变的间接毒性作用机制

1 引言

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要试剂

2．3 主要实验仪器与耗材

3 实验方法

3．1 RAECs原代培养方法

3．2 纳米颗粒悬液的配制与细胞染毒

3．3 RAECs细胞活性测定

3．4 炎性因子刺激模型的建立及RAECs分泌凝血纤溶相关活性因子的表达

3．5 内皮细胞间接暴露模型的建立

3．6 间接暴露对RAECs分泌凝血纤溶相关因子的影响

3．7 Western Blot检测RAECs相关蛋白的表达

3．8 统计学处理

4 实验结果

4．1 RAECs的鉴定

4．2 RAECs活性测定结果

4．3 炎性因子诱导RAECs分泌凝血纤溶相关因子的表达

4．4 间接暴露对RAECs分泌凝血纤溶相关因子的影响

4．5 RAECs相关蛋白的表达结果

5 小结

6 讨论

7 附表

结论

参考文献

文献综述 炎性因子与血管内皮功能在机体凝血纤溶系统中的作用

代表性论著

个人简介

致谢