基于磁性微粒和荧光微球的DNA检测方法研究

摘要

近年来，新型纳微米级微球/粒成为生物医学领域的研究热点，以其作为载体或报告信号的一些生物分子检测技术已经商业化。该工作开展了大肠杆菌和高危型人乳头瘤病毒(HPV)的DNA检测研究，对微球技术在细菌及病毒核酸检测新方法建立方面奠定了基础。 固定有寡核苷酸探针的磁性微粒与待测DNA片段杂交后进行单碱基链延伸反应并进一步引入荧光信号实现DNA的检测。在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)介导下，将5'-氨基标记的寡核苷酸探针共价结合于羧基末端磁性微粒表面，通过探针与PCR扩增片段的杂交、生物素标记的ddNTP在磁性微粒表面的单碱基链延伸反应、引入藻红蛋白标记的链亲和素等反应，完成对大肠杆菌DNA的杂交检测过程，最后将磁性微粒点到载玻片上，通过芯片扫描仪判读检测结果。不对称PCR扩增大肠杆菌23S DNA片段为390 bp，每毫克磁性微粒表面最大可偶联探针0.65 nmol，偶联效率高达97.60％，杂交检测的结果表明，检测点的荧光强度可达对照点的21倍，具有很强的特异性。基于羧基磁性微粒所建立的DNA检测方法，整个检测过程所需仪器设备简单，增大了实用性和可操作性，并且检测时间仅需5 h，大大缩短了DNA检测所用的时间，在临床上的应用奠定了基础。 在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)介导下，将针对3型(HPV18，33，35)的三种不同序列的5'-氨基标记的寡核苷酸探针共价结合于荧光微球表面。以通用引物Gp5/Gp6(Gp6 5'-biotin)，从HPV基因组中扩增HPV L1区150 bp的DNA片段后，将PCR产物与偶联有型特异性探针的荧光微球相互反应，最后加入藻红蛋白标记的链亲和素引入检测信号。基于荧光微球地址可寻以及只有形成复合物的荧光微球上的荧光信号强度会明显升高等特点，通过Imminex<'TM>100检测HPV的DNA，并判断该病毒的型别。各型探针与相应的PCR产物结合后，其检测的荧光信号值明显高于背景值，阳性值/阴性值最高可达近百倍，最低也有8倍以上，鉴别DNA的准确率达到100％。荧光微球表面探针密度高，产生信号强，同时荧光检测使信号进一步得到放大，所以敏感性大大提高。在临床检测中使用通用引物，仅需一次PCR扩增即可检测多种待测样品，既提高了检测的通量，也大大降低了临床标本的用量。同时，杂交在悬浮的液相中进行，杂交后不用清洗就可以直接读数，所用时间从几小时缩短到30分钟，检测效率大大高于固相杂交。基于微球技术杂交检测DNA方法与其它方法相比，更易于操作，省时省力，通量高，结果判别准确，在研究及临床检测中具有潜在的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

声明

缩略语表

第一章文献综述

第二章基于磁性微粒的DNA杂交检测

1材料

1.1磁性微粒

1.2菌种及菌体序列

1.3培养基

1.4主要试剂的配制

1.5引物与探针

1.6主要试剂

1.7仪器设备

2方法

2.1检测原理

2.2探针与微粒的偶联

2.3靶片段的扩增

2.4 PCR产物与固定有寡核苷酸磁性微粒的杂交反应

2.5磁性微粒表面的单碱基链延伸反应

2.6荧光信号的引入以及结果读取

3结果与讨论

3.1磁性微粒的优选

3.2磁性微粒与氨基标记探针偶联效率的测定

3.3不对称PCR上下游引物的优化结果

3.4不对称PCR扩增结果

3.5荧光信号引入时洗涤条件的优化结果

3.6检测结果

4小结

第三章荧光微球用于人乳头瘤病毒的基因分型研究

1材料

1.1标准株质粒

1.2菌种

1.3培养基

1.4引物及探针

1.5主要试剂

1.6仪器设备

2方法

2.1技术路线

2.2探针与微粒的偶联

2.3靶片段的扩增

2.4被检测物与探针的杂交反应

2.5 HPV标准质粒的检测

3结果与讨论

3.1靶片段扩增结果

3.2 HPV标准质粒的检测结果

4小结

全文小结

参考文献

致谢