猪胰腺α-淀粉酶变性-复性过程及其部分折叠中间体的研究

摘要

本文应用荧光相图法研究了脲和盐酸胍诱导猪胰腺α-淀粉酶变性过程及其复性过程的路径，捕捉变性、复性过程中存在的部分折叠中间态；应用十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究了在脲变性猪胰腺α-淀粉酶复性过程中聚集体的形成及成因。本研究结果为探索蛋白质折叠机理提供了有益的帮助。 猪胰腺α-淀粉酶变性过程的荧光相图法检测结果表明：脲作为变性剂时，无论有没有还原剂2-巯基乙醇存在，猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程均只出现一个部分折叠中间体，符合“三态模型”。盐酸胍诱导的猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程中，在没有还原剂2-巯基乙醇存在的情况下出现了两个部分折叠的中间体，变性过程符合“四态模型”；而当变性体系中有还原剂存在时，变性过程只出现了一个中间体，此时变性过程符合“三态模型”。 变性猪胰腺α-淀粉酶复性过程的荧光相图法检测结果表明：脲变性猪胰腺α-淀粉酶的复性过程，在有还原剂和无还原剂的条件下都符合“三态模型”，存在一个中间体，但形成中间体的脲浓度不同；非还原盐酸胍变性猪胰腺α-淀粉酶的复性过程没有中间体的出现，符合“二态模型”；还原盐酸胍变性猪胰腺仅。淀粉酶的复性过程出现了一个部分折叠中间体。 用非还原和还原SDS-聚丙烯酰胺电泳研究脲变性猪胰腺α-淀粉酶在脲溶液中稀释复性时聚集体形成的原因。发现还原脲变性猪胰腺α-淀粉酶在稀释复性过程中由于分子间二硫键的错配而形成了可溶性的聚集体。非还原脲变性猪胰腺α-淀粉酶在稀释复性过程中也会形成聚集体，经还原电泳分析这些聚集体是由于猪胰腺α-淀粉酶分子上游离的半胱氨酸残基分子间错配形成的。

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摘 要

Abstract

第一章文献综述

1.1蛋白质变性

1.2蛋白质折叠的研究现状

1.3蛋白质折叠的机制

1.3.1蛋白质折叠的动力学与热力学控制学说

1.3.2多维能量景观学说

1.3.3蛋白质折叠机制假说

1.4蛋白质折叠过程中间态的研究

1.5蛋白质复性过程中集聚体的研究

1.6本实验的内容、目的、意义

第二章试验材料与方法

2.1主要试剂与仪器

2.1.1试剂

2.1.2仪器

2.2实验方法

2.2.1荧光像图

2.2.2十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.2.3凝胶排阻色谱法

第三章用荧光相图法研究猪胰腺α-淀粉酶去折叠和重折叠过程

3.1猪胰腺α-淀粉酶去折叠过程的研究

3.1.1脲诱导猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程

3.1.2盐酸胍诱导猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程

3.1.3变性剂对猪胰腺α-淀粉酶去折叠过程的影响

3.1.4还原剂2-巯基乙醇对猪胰腺α-淀粉酶去折叠过程的影响

3.2猪胰腺α-淀粉酶复性过程的研究

3.2.1腺变性猪胰腺α-淀粉酶的复性过程

3.2.2盐酸胍变性猪胰腺α-淀粉酶的复性过程

3.2.3还原剂2-巯基乙醇对猪胰腺α-淀粉酶重折叠过程的影响

3.3猪胰腺α-淀粉酶变性过程与复性过程的比较

3.4还原剂2-巯基乙醇对猪胰腺α-淀粉酶变性过程和复性过程的影响

3.5猪胰腺α-淀粉酶在脲和盐酸胍溶液中变性机制的比较

第四章脲变性猪胰腺α-淀粉酶稀释复性过程集聚体的研究

4.1脲变性猪胰腺α-淀粉酶在凝胶排阻色谱上的复性

4.1.1凝胶排阻色谱复性非还原脲变性猪胰腺α-淀粉酶

4.2.2凝胶排阻色谱复性还原脲变性猪胰腺α-淀粉酶

4.2 SDS-PAGE电泳对脲变性猪胰腺α-淀粉酶复性过程集聚体的研究

4.2.1天然态猪胰腺α-淀粉酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

4.2.2非还原脲变性猪胰腺α-淀粉酶稀释复性液的SDS-PAGE电泳

4.1.3还原脲变性猪胰腺α-淀粉酶稀释复性液的SDS-PAGE电泳

第五章研究总结与展望

5.1结论

5.2本实验不足和展望

参考文献

致谢