液相色谱法对不同状态蛋白的快速分离和鉴定

摘要

基因重组蛋白的复性问题是生物工程下游技术中的一个瓶颈。对于蛋白复性过程中所形成的中间体(M state)的研究是解决促进蛋白进行正确折叠的关键。蛋白折叠色谱是近年来出现的一个新的复性方法，它不仅可以实现蛋白折叠过程中不同分子构象状态的分离，而且该方法也可用于研究蛋白的分子构象变化，并用计量置换理论(stoichiometric displacement theory，SDT)中的两个线性参数z和log/对蛋白变性及复性过程中产生的不同分子构象状态其进行表征，所以用蛋白质折叠液相色谱法和SDT来对蛋白折叠及折叠中间体进行研究是当前生物技术中的一个新方法。二维及多维液相色谱法已成为分析化学中复杂体系组分分离和分析的强有力工具，尤其在蛋白质组学研究中对整体(intact)天然蛋白(N态)的预分离方面。由于传统的二维及多维液相色谱本身存在的一些缺陷而限制了其在蛋白质组学研究方面的广泛应用，因此对二维液相色谱方法的改进及发展目前仍为国内外蛋白组学及色谱研究的热点之一。 论文包括以下5个部分： 1.文献综述：蛋白折叠过程中产生的中间体在很大程度上阻碍了变性蛋白(U态)向具有生物活性的天然态的转变，而且由于中间体的寿命非常短使得难以对其进行分离和捕获，因此对蛋白折叠及折叠中间体的研究具有重大的理论意义和重要的实际价值，目前的研究还一直处于经验摸索的阶段。本文从蛋白折叠及折叠中间体形成的原因、研究策略、方法及进展进行了全面地综述。在二维液相色谱(tWO dimensional liquid chromatography,2DLC)方面，全面介绍了目前二维及多维液相色谱(MDLC)发展的方向以及存在的问题，共包括文献160篇。 2.用疏水相互作用色谱法对脲变 -糜蛋白酶(a-Chy)折叠中间体进行了研究，通过HIC在动态条件下在线制备和纯化出一个稳定的a-Chy中间体。在不同的脲变条件下测定了天然和中间体a-Chy的Z、lgI和j值，结果发现，当脲浓度不同时，天然和中间体a-Chy与固定相表面的这三个不同参数有很大区别，其中天然a-Chy的z和lgI之间有很好的线性关系，而中间体却没有，并且中间体的Z和lgI值要比天然态的小得多，根据这三个参数的不同可以用来区分蛋白的不同分子构象状态，建立了一个在线折叠液相色谱表征a-Chy中间体的新方法。 3.以脲变 - 糜蛋白酶(a-Chy)为模型蛋白，用蛋白折叠液相色谱法研究了该蛋白在6种不同固体表面上的折叠及其在折叠过程中形成的中间体，选用疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相为吸附剂，在动态条件下着重研究了疏水色谱固定相TSK和PEG-600表面对脲变a-Chy复性效率的贡献。用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱对3.0 mol/L，脲变a-Chy，在经HPHIC柱复性并同时分离的收集组分进行确认后，仅有一种稳定的脲变a-Chy折叠中间体。并通过活性测定发现该折叠中间体难以复性并具有低的生物活性，但PEG-600固定相表面较TSK固定相对a-Chy复性效果好。证实了疏水性强度及固体表面配基的结构对蛋白折叠起着关键性的作用。 4.通过实验合成了三种具有弱阳('WCX)和疏水(}tIC)性质的双功能色谱固定相(bi-functional stationary phase)，通过对这几种固定相的表征发现该双功能固定相无论在IEC模式下还是在HIC模式下对蛋白都有很高的分辨率，因此这种色谱柱称之为WCX-HIC柱，并简要描述了WCX-HIC柱对蛋白的分离原理。蛋白在IEC和HIC的保留强弱可以根据配基的种类，加入的量以及合成条件的不同进行控制。实验测得该类型的双功能色谱固定相在两种模式下都具有很大的动力学吸附量，而且通过对标准蛋白的质量回收率测定发现，这几种标准蛋白分别在这两种模式下的质量回收率都大于96％，表明该类型的固定相对蛋白的不可逆吸附很小。在此基础上首次提出了用一根色谱柱来实现离子交换和疏水色谱快速分离整体蛋白的新方法。在选择合适的固定相、流动相、缓冲液交换方法及二次进样的条件下，在1小时内用同一根色谱柱完成了通常用两根色谱柱和在两种流动相条件才能实现的“二维色谱”分离，并且能维持蛋白原有的三维和四维分子结构。通过和最好的商品TSK离子交换和疏水色谱柱比较发现，本实验合成的双功能固定相在单独的IEC和HIC模式下可以和TSK柱相媲美。而且从峰容量来看，由于双功能色谱柱可以用于二维色谱分离，因此在IEC～HIC或HIC～IEC的二维色谱模式下其峰容量(n1×n2)大大超过一根色谱柱，比如TSK柱。 5.首次将合成的双功能色谱柱用于特殊模式的2DLC蛋白分离，即蛋白单柱二维液相色谱法(two-dimensional LC by a single column，2DLC-1C)。该2DLC-1C既可以在离线，也可以在在线模式下对蛋白进行分离，后者称之为在线2DL-1C。通过解决在线缓冲液的快速交换，实现了大体积的样品或收集液(0.001～100mL)进行连续或非连续的在线进样。首次将2DLC-1C用于分析和制备规模上的在线蛋白二维分离。通过离线和在线模式下实验了对标准蛋白的二维分离以及对实际样品人血清的快速预分离，取得了非常满意的效果。这种2DLC.1C的优点有：(1)整个蛋白分离都是在密封的体系中进行的，从而防止了样品的污染；(2)所有的样品组分都是定量地转移到下一步的操作；(3)所有的蛋白都保持其天然状态；(4)原样的复杂性大大简化，比如1/10～1/100，甚至更小；(5)每一种蛋白的相对丰度，尤其蛋白质组学中可以提高低丰度蛋白的浓度10～100倍，甚至更高；(6)容易实现操作自动化；(7)可以在线进行天然或整体蛋白的快速分离：(8)该方法不但可以提高信息的可靠性，而且可以获得蛋白组学研究的纯的蛋白；(9)对天然产物或动物体液的分离，可以获得高的质量回收率和活性回收率；(10)费用非常低。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

第一篇蛋白折叠及折叠中间体

1.1研究蛋白折叠及折叠中间体的意义

1.2蛋白质的变性

1.3蛋白多肽链折叠中间体

1.4促进蛋白质体外折叠的策略

1.5折叠中间体的研究方法和技术手段

1.6蛋白折叠液相色谱法（Protein Folding Liquid Chromatography,PFLC）研究蛋白折叠中间体

1.7 SDT-R蛋白折叠中间体的表征

第二篇二维液相色谱法

1.8二维液相色谱法研究的意义

1.9二维液相色谱的发展

1.10色谱柱联用类型

1.11接口技术

1.12二维色谱用于蛋白质和多肽分离

参考文献

第二章用疏水相互作用色谱法在线分离和研究α-糜蛋白酶的中间体的性质

2.1前言

2.2原理

2.3实验部分

2.3.1仪器

2.3.2试剂

2.3.3实验方法

2.4结果与讨论

2.4.1 α-Chy稳定中间体的制备和鉴定

2.4.2 M态和U态的区别

2.4.3 lgk’和lgαH2O的线性关系

2.4.4天然和中间体α-Chy的Z(S)和lgI

2.4.5脲浓度对lgI和Z的影响

2.4.6不同脲浓度下的lgI和Z的线性关系

2.4.7 Z值与生物活性之间的关系

2.4.8折叠液相色谱法对α-Chy折叠中间体研究的机理

2.5小结

参考文献

第三章固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡献

3.1前言

3.2实验

3.2.1仪器和材料

3.2.2主要试剂

3.2.3实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1脲变α-Chy在6种疏水色谱柱上复性并同时分离的色谱行为

3.3.2 MALDI-TOF-MS对α-Chy折叠中间体确认

3.3.3不同浓度脲变α-Chy在不同固定相上的活性回收率

3.3.4脲浓度对α-Chy复性比活的影响

3.3.5 TSK柱后脲变α-Chy折叠中间体的分离

3.3.6不同浓度脲变α-Chy在不同固定相上的活性回收率和质量回收率

3.3.7不同流动相对脲变α-Chy的活性回收率和质量回收率的影响

3.3.8不同脲变浓度的α-Chy在PEG-600柱上Z和lgI及j值的测定

3.3.9相同脲变浓度下的α-Chy在不同固定相上的Z和lgI的测定

3.3.10 α-Chy的折叠自由能△GF

3.4小结

参考文献

第四章二维液相色谱固定相的合成及表征

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1仪器

4.2.2试剂

4.2.3填料的合成

4.2.4羧基含量的测定

4.2.5色谱柱的填装

4.2.6色谱条件

4.2.7紫外分光光度法测定蛋白浓度：

4.2.8 Bradford法测定蛋白含量：

4.2.9容量因子的测定方法

4.3结果与讨论

4.3.1二维色谱填料的合成及其评价

4.3.2 HIC～WCX柱负荷

4.3.3 WCX～HIC柱的双保留机理

4.3.4在同一根色谱柱上同时对蛋白进行离子交换和疏水模式分离

4.3.5峰容量的测定

4.3.6蛋白在WCX～HIC固定相上的质量回收率

4.3.7二维色谱柱同商品TSK柱的性能比较

4.4小结

参考文献:

第五章在线单柱蛋白二维液相色谱法

5.1前言

5.2实验部分

5.2.1仪器

5.2.2试剂

5.3结果与讨论

5.3.1 WCX～HIC用于单柱蛋白二维液相色谱分析

5.3.2累积进样或连续进样对保留时间的影响

5.3.3累积或连续进样对分离度的影响

5.4单柱二维色谱法对人血清样品的分离

5.5单柱二维色谱法的对混合蛋白的分离模式

5.6在线2DLC-1C仪器系统

5.7样品缓冲液的交换

5.8在线蛋白单柱二维液相谱系统对标准蛋白的二维分离

5.9小结

参考文献

论文发表情况

致谢