蛋白折叠液相色谱法复性与同时纯化重组人Flt3配体的研究

摘要

近年来，蛋白折叠液相色谱(Protein folding liquid chromatography,PFLC)法越来越多地被应用于包涵体蛋白复性与同时纯化中，PFLC的特点是能在色谱过程将目标蛋白与其它组分分开的同时，还能在色谱柱上进行变性蛋白折叠。本论文①对在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3 ligand，rhFL)进行了摇瓶中菌种培养条件的优化，获得了高表达的rhFL包涵体蛋白；②经超声破碎、离心并多次洗涤沉淀获得纯化的包涵体，并将其溶解于8 mol/L脲中得到变性蛋白的抽提液；③利用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)法，包括一个分析型HPHIC柱、半制备型HPHIC饼和新型单柱二维液相色谱(A novel two-dimensional liquid chromatographyusing a single column，2DLC-1C)柱进行rhFL包涵体复性与同时纯化的保留特征和复性规律的研究，为大规模制备rhFL蛋白和将其用于临床研究奠定基础。
　　 本论文共有四个部分：
　　 1.文献综述：对近年来不同机理的PFLC法在蛋白质折叠与同时纯化中的进展和应用，以及FL的结构、生物学功能及临床应用的重要性进行了综述。
　　 2.摇瓶中rhFL菌种培养条件的优化：研究了摇瓶中培养基、培养条件(温度、诱导时间、pH、接种量)对rhFL表达的影响。实验结果表明，在培养温度为35℃、选用初始pH值为6.6的SOB培养基、甘油做为碳源、诱导4 h、接种量为4％的条件下，rhFL蛋白的表达量可占菌体总蛋白的47.4％。
　　 3.HPHIC法对E.coli表达的rhFL包涵体复性与同时纯化：分别选用不同规格的色谱柱(分析型色谱柱、半制备型色谱饼)，通过色谱流动相(小分子添加剂、流速)和进样量对rhFL复性与纯化过程中质量回收率的影响，筛选出rhFL包涵体蛋白在HPHIC柱上复性与纯化的最佳条件和保留规律，初步用荧光光谱法考察了rhFL在色谱柱上复性前后荧光强度变化，并用HPHIC饼对rhFL进行规模化制备。结果分别在固定相配基为苯基的分析型色谱柱、半制备色谱饼上复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率可达45.9％、67.0％，纯度分别为93.5％、92.1％。对G-CSF依赖株NFS-60的细胞增殖作用的活性结果表明，当与G-CSF协同作用时，平均比活为7.42×108 IU/mg。
　　 4.新型单柱二维色谱柱对rhFL包涵体复性与同时纯化：新型2DLC-1C柱是在一根色谱柱上兼具有了HIC和IEC两种保留模式，已被用于活性蛋白的快速分离。本工作选用了2DLC-1C柱的HIC模式与和以苯基为配基的HPHIC柱，比较两种色谱柱对rhFL复性与同时纯化过程中流动相的洗脱的盐浓度变化对目标蛋白质量回收率的影响。实验结果显示，在以苯基为配基的色谱柱上，当流动相(NH4)2SO4盐浓度为3.0 mol/L时，rhFL的质量回收率可达到48.7％。而新型的2DLC-1C柱，当流动相为2.0 mol/L(NH4)2SO4时，即可获得的质量回收率为48.5％。从而证实新型填料的2DLC-1C柱在较低盐浓度下可达到较高的质量回收率。此结果也提示这种新型的双保留模式色谱柱，有可能降低规模化制备rhFL蛋白的成本。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1前言

1.2蛋白折叠液相色谱法

1.3 PFLC法在重组蛋白复性与同时纯化中的应用

1.3.1 PF-HIC法的复性与同时纯化

1.3.2 PF-IEC法的复性与同时纯化

1.3.3 PF-AFC法的复性与同时纯化

1.3.4 PF-SEC法的复性与同时纯化

1.3.5包涵体蛋白的规模化制备柱技术

1.4荧光光谱技术追踪复性过程中构象变化

1.5 FL基因工程研究的概述

1.5.1 FL基因的克隆及结构

1.5.2 FL的生物学功能及临床应用

1.5.3 FL基因在E.coli中的表达、复性及纯化

1.6本实验的研究工作

参考文献

第二章摇瓶中rhFL菌种培养条件的优化

2.1引言

2.2仪器与材料

2.2.1质粒与菌种

2.2.2仪器

2.2.3试剂

2.3实验方法

2.3.1发酵试剂的配制

2.3.2菌种的培养

2.3.3结果测定

2.4结果与讨论

2.4.1温度对rhFL菌体生长、表达的影响

2.4.2不同培养基对rhFL菌体生长、表达的影响

2.4.3碳源对rhFL菌体生长、表达的影响

2.4.4诱导表达时间对rhFL菌体生长、表达的影响

2.4.5 pH值对rhFL菌体生长、表达的影响

2.4.6接种量对rhFL菌体生长、表达的影响

2.4.7优化条件下rhFL菌体生长和表达情况

2.5小结

参考文献

第三章HPHIC法对E.coli表达的rhFL包涵体复性与同时纯化

3.1引言

3.2仪器与试剂

3.2.1仪器

3.2.2试剂

3.3实验方法

3.3.1 rhFL包涵体的前处理

3.3.2 HPHIC对rhFL复性与纯化

3.3.3电泳样品的预处理

3.3.4 Bradford法测定蛋白含量

3.3.5 rhFL对G-CSF依赖株NFS-60的细胞增殖作用

3.3.6荧光光谱分析

3.4结果与讨论

3.4.1以苯基为配基的分析型HPHIC柱上rhFL复性与同时纯化

3.4.2以苯基为配基的半制备HIC饼上rhFL复性与同时纯化

3.5蛋白质复性过程的荧光光谱分析

3.5.1 HPHIC法复性与同时纯化色谱峰馏分的荧光分析

3.5.2最优条件下HPHIC法复性与同时纯化色谱峰馏分的荧光分析

3.5.3不同复性方法的荧光比较

3.6 rhFL对G—CSF依赖株NFS-60细胞的增殖作用

3.7小结

参考文献

第四章新型单柱二维色谱柱对rhFL包涵体复性与同时纯化

4.1引言

4.2仪器与试剂

4.3实验方法

4.4结果与讨论

4.4.1配基为苯基的HPHIC柱上盐浓度变化对rhFL复性与同时纯化的影响

4.4.2 2DLC-1C柱上盐浓度变化对rhFL复性与同时纯化的影响

4.4.3两种色谱柱上盐浓度变化对rhFL复性与同时纯化的影响

4.5小结

参考文献

论文总结

硕士期间发表论文情况

致谢