载体吸附交联及无载体交联固定化磷脂酶D方法的研究

摘要

磷脂酶D作为磷脂酰基转移反应的催化剂，广泛应用于催化合成各种功能性磷脂产品，因此倍受关注。制备得到催化活力高、操作简便、保存稳定性好的固定化酶是磷脂酶D应用研究的关键课题。本文在前序工作的基础上，以酶分子交联为核心，尝试采用吸附-交联、吸附-聚集-交联、以及无载体的聚集交联三种方法对磷脂酶D进行固定化，研究酶固定化的操作条件、固定化磷脂酶D的性能，为酶固定化方法和磷脂酶D应用研究提供依据。
　　 以实验室筛选保藏的链霉菌菌株发酵生产磷脂酶D，研究酶的初步分离纯化工艺。结果表明，发酵液离心所获得的粗酶液经硫酸铵-乙醇协同沉淀纯化后，比活力可达10.45U/mg，纯化倍数达11.32倍，分离纯化的酶活力回收率达87％。这为固定化研究提供了良好的酶来源。吸附与交联相结合是对游离酶进行载体固定化的常用方法。本文首先采用吸附-交联法探索PLD的固定化。以微晶纤维素、硅藻土、多孔硅胶作为载体，戊二醛作为交联剂。研究表明，硅藻土吸附效果最好；以其为载体的最优吸附-交联固定化条件为：酶液(比活力为：10.45 U/mg)与载体比例：4∶1(mL/g)，吸附时间为3h，戊二醛浓度为1.5％，交联时间为3h。最优条件下，酶活力回收率为65％，固定化磷脂酶D的活力为5.56U/mg。酶固定化回收率低、载酶量有待提高。
　　 基于沉淀剂作用下酶分子相互聚集、溶解度降低，被载体吸附趋势增加的考虑，提出以沉淀聚集作用促进酶的吸附-交联固定化，即进行酶的吸附-聚集-交联固定化的研究方案。沉淀剂分别采用硫酸铵、乙醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、甲醇、PEG6000；交联剂为戊二醛。沉淀过程对酶稳定性的影响通过沉淀-复溶法评价，乙醇引起的活力损失率最小，沉淀-复溶的活力回收率达91％。通过单因素考察及响应面分析，优化了吸附-聚集-交联固定化的操作条件。硅藻土为载体、沉淀pH8.2、无水乙醇饱和度81.6％、戊二醛浓度2.87％、交联时间4h、载体与酶液(比活力为：10.45 U/mg)的比例1:4(g/mL)。磷脂酶D活力回收率达到89％，固定化酶活力为7.36U/mg。重复使用10批次后剩余活力为60％。新方法固定化磷脂酶D显著提高了固定化效率和操作稳定性。
　　 为了与沉淀-交联固定化的典型方法相比较，本文还尝试了以无载体的交联酶聚集体(CLEAs)技术固定化磷脂酶D。以乙醇为沉淀剂、戊二醛为交联剂，得到PLD-CLEAs的最佳条件：酶液浓度为0.2g-protein/mL(比活力为：9.5 U/mg)，乙醇饱和度为72.6％，戊二醛浓度为0.22％，交联时间为1.8h。酶固定化最大酶活力回收率能够达到86％，固定化酶活力达到15.62 U/mg。重复使用10批次以后，相对酶活力保留55％。交联酶聚集体法固定化磷脂酶D取得与吸附-聚集-交联固定化相近的效果。以酶分子交联为核心，辅助沉淀作用可以较高的活力回收率实现磷脂酶D无载体交联聚集固定化和载体吸附-交联固定化，固定化酶稳定性良好。

目录

文摘

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论文说明：勘误声明

声明

第一章 综述

1.1研究问题的提出

1.2磷脂及磷脂酶D

1.2.1磷脂的简介

1.2.2磷脂的改性

1.2.3磷脂酶D的简介

1.3酶的固定化技术

1.3.1载体固定化酶技术

1.3.2无载体固定化酶技术

1.4本课题的研究内容

1.4.1研究目的

1.4.2研究意义

1.4.3研究内容

第二章 磷脂酶D的发酵制备及分离纯化

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

2.1.2实验试剂

2.2实验方法

2.2.1磷脂酶D粗酶液的制备

2.2.2发酵液性质的检测

2.2.3磷脂酶D的纯化

2.3结果与讨论

2.3.1发酵液性质的检测结果

2.3.2不同方法纯化磷脂酶D效果比较

2.3.3磷脂酶D纯化工艺

2.4本章小结

第三章 磷脂酶D的载体吸附交联固定化研究

3.1实验材料

3.1.1实验用酶

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.2实验方法

3.2.1吸附-交联固定化磷脂酶D的制备

3.2.2固定化条件的优化

3.2.3检测方法

3.3结果与讨论

3.3.1载体的选择

3.3.2酶液量与载体比例的选择

3.3.3吸附时间的确定

3.3.4戊二醛浓度的确定

3.3.5交联时间的确定

3.4本章小结

第四章 磷脂酶D的载体聚集交联固定化方法的研究

4.1实验材料

4.1.1实验用酶

4.1.2实验仪器

4.1.3实验试剂

4.2实验方法

4.2.1磷脂酶D的吸附-聚集-交联固定化

4.2.2固定化条件的优化

4.2.3检测方法

4.3结果及讨论

4.3.1固定化条件的优化结果

4.3.2固定化条件的响应面分析

4.4本章小结

第五章 磷脂酶D无载体交联固定化研究

5.1实验材料

5.1.1实验用酶

5.1.2实验仪器

5.1.3实验试剂

5.2实验方法

5.2.1交联磷脂酶D聚集体的制备

5.2.2交联磷脂酶D聚集体制备条件的优化

5.2.3检测方法

5.3结果及讨论

5.3.1固定化条件优化结果

5.3.2 CLEAs固定化条件的响应面分析

5.4本章小结

第六章 几种固定化磷脂酶D的性能比较

6.1实验材料

6.1.1实验仪器

6.1.2实验试剂

6.2实验方法

6.2.1固定化磷脂酶D的制备

6.2.2固定化磷脂酶D性能的测定

6.3结果及讨论

6.3.1温度对固定化酶活性和稳定性的影响

6.3.2 pH对固定化酶活性和稳定性的影响

6.3.3固定化酶的有机溶剂耐受性

6.3.4固定化酶的保存稳定性

6.3.5固定化酶的操作稳定性

6.4本章小结

总结及展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢