人CYP2C8多态性功能及CYP2C8基因依赖性药物相互作用的体外研究

摘要

目的：CYP2C8基因多态性是造成个体间CYP2C8的药物代谢能力产生巨大差异的因素之一。主要CYP2C8基因多态性功能的系统性研究，具有重要的药理学和毒理学意义，可为CYP2C8代谢表型预测和经CYP2C8代谢药物的个体化用药提供数据和信息。但目前仍缺乏在统一的CYP表达体系和相同的检测系统中，研究CYP2C8重要等位基因功能的相关报道。CYP2C8药物代谢能力的个体差异可能会导致携带CYP2C8多态性基因型的患者，对CYP2C8介导的代谢性药物相互作用的敏感性增加，而导致恶性药物毒副作用。现阶段，尚未有研究证明CYP2C8基因多态性是否会影响药物间相互作用的发生和机制，以及能否会引起药物相互作用的个体差异。本课题研究中，我们针对CYP2C8主要基因多态性功能改变，以及CYP2C8基因型依赖的药物相互作用等尚未解决的科学问题展开系统研究和分析。
　　 方法：首先，选取野生型CYP2C8(CYP2C8.1)，3个重要的CYP2C8等位基因(CYP2C8.2，CYP2C8.3，CYP2C8.4)以及CYP2C8.3携带的两个重要SNPs(R139和K399R)，应用体外重组和蛋白表达技术，将CYP2C8.1和5种CYP2C8变异体于相同的表达体系中进行表达，构建涵盖主要CYP2C8多态性的CYP2C8多态性基因文库和蛋白文库；利用已构建成功的CYP2C8多态性蛋白文库，研究体外重组CYP2C8.1和5种重要CYP2C8突变体对抗肿瘤药物(紫杉醇)和抗疟疾药物(阿莫地奎)代谢功能的差异，在此基础上系统性分析CYP2C8基因多态性对CYP2C8酶学性质改变的效应关系。在系统性分析了CYP2C8多态性功能的基础上，我们评估了10类共27种临床常用药物对CYP2C8.1和5种CYP2C8突变体紫杉醇催化活性的抑制程度，并根据体外抑制数据预测受测药物和紫杉醇，在不同CYP2C8基因型中，体内药物间相互作用的发生风险。其次，我们初步建立了一种基于荧光底物的，针对于CYP2C8介导的代谢性药物相互作用的高通量检测方法，用于快速评估药物或新药候选化合物对不同CYP2C8多态性的体外抑制程度。
　　 结果：对CYP2C8野生型及其5种突变体的功能研究表明：1、CYPs体外重组技术可应用于CYP多态性功能研究和体外药物代谢机制研究；2、CYP2C8体外代谢紫杉醇和阿莫地奎的研究显示，本系统表达纯化的CYP2C8.1具有正常的药物催化活性，获得的酶动力学参数Km与已有报道数据相近。3、与CYP2C8.1相比，R139K的药物代谢能力无显著变化，CYP2C8.2，CYP2C8.3，CYP2C8.4和K399R的药物代谢能力有不同程度的降低，其中K399R的代谢能力最低。药物相互作用研究表明：1、紫杉醇和受测药物的体外药物相互作用研究结果显示，受测药物对CYP2C8突变体的半数抑制常数(IC50)，与CYP2C8.1相比存在明显差异，CYP2C8基因多态性可能对CYP2C8介导的代谢性药物相互作用产生影响；2、紫杉醇和受测药物间体内相互作用的预测结果显示，不同CYP2C8基因型可能导致体内相互作用性质的改变。3、基于体外重组CYPs和荧光底物的高通量药物抑制检测方法可以用于体外药物相互作用的快速检测和初步研究；
　　 总结：本研究从CYP2C8药物代谢功能和CYP2C8抑制介导的代谢性药物相互作用两方面，研究了CYP2C8基因多态性的影响效应。系统性分析CYP2C8多态性功能将为CYP2C8表型预测，为经CYP2C8代谢的药物，尤其是紫杉醇和阿莫地奎的个体化用药提供更加均一化的数据和信息。紫杉醇和27种临床常用药物相互作用研究将为临床药理学研究人员提供体内和体外药物代谢抑制数据，以进一步评估和解决临床中CYP2C8基因型依赖的代谢性药物相互作用。同时也为根据体外抑制数据预测体内药物相互作用提供了新的思路。另外，以荧光底物为基础的药物抑制检测平台，将为药物和新药化合物体外抑制检测提供快速、灵敏、高通量的分析方法和手段。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

1.1前言

1.2文献综述

1.2.1 CYP酶系概述

1.2.2 CYP分布

1.2.3 CYP底物催化机制及其功能

1.2.4 CYP结构和功能关系

1.3主要CYP亚家族研究进展

1.2.1主要CYPs亚家族与药物代谢

1.3.2 CYP基因多态性研究进展

1.3.3 CYP2C8与药物代谢

1.3.4 CYP与代谢性药物相互作用

1.3.5 CYP抑制导致的药物相互作用

1.3.6 CYP基因多态性与药物相互作用

1.3.7体外及体内代谢性药物相互作用的预测

1.3.8药物代谢和安全性评价中常用研究模型

1.4立题目的和意义

第二章重组CYP2C8及5个CYP2C8突变株的表达和纯化

2.1材料

2.1.1表达载体和菌株

2.1.2主要试剂

2.1.3主要溶液及主要培养基

2.1.4主要实验仪器

2.2实验方法

2.2.1人CYP2C8野生型及5个CYP2C8突变体重组表达载体的构建

2.2.2人CYP2C8野生型及5个CYP2C8突变体重组酵母表达体系的构建

2.2.3人CYP2C8野生型及5个突变体膜蛋白的表达和鉴定

2.2.4人CYP2C8野生型及5个突变体微粒体制备和功能性CYP2C8含量的检测

2.3结果

2.3.1构建人CYP2C8野生型及5个CYP2C8突变体重组表达载体

2.3.2人CYP2C8野生型及5个CYP2C8突变体膜蛋白表达鉴定

2.4讨论

2.4.1选择酵母细胞作为CYP2C8体外重组表达系统

2.4.2 CYP2C8基因多态性对功能CYP2C8含量的影响

第三章5个CYP2C8突变体多态性功能研究

3.1材料

3.1.1主要试剂

3.1.2主要溶液

3.1.3主要仪器

3.2实验方法

3.2.1确定和优化液相色谱条件

3.2.2制作标准曲线

3.2.3确定CYP2C8野生型和突变体催化紫杉醇和阿莫地奎的反应条件

3.2.4 CYP2C8野生型和5个CYP2C8突变体催化活性的比较

3.2.5 CYP2C8野生型和突变体催化紫杉醇和阿莫地奎酶促动力学的检测

3.2.6数据处理

3.3结果

3.3.1液相色谱条件的确立

3.3.2标准曲线

3.3.3 CYP2C8野生型和突变体催化紫杉醇和阿莫地奎的反应条件

3.3.4比较CYP2C8野生型和5个CYP2C8突变体催化活性的结果

3.3.5 CYP2C8野生型和突变体催化紫杉醇和阿莫地奎酶促动力学检测结果

3.4讨论

3.4.1 CYP2C8野生型和5个CYP2C8突变体底物催化活性差异

3.4.2 CYP2C8野生型和5个CYP2C8突变体催化紫杉醇和阿莫地奎酶学动力学分析

第四章CYP2C8抑制作用介导的代谢性药物相互作用研究

4.1材料

4.1.1主要试剂

4.1.2主要溶液

4.1.3主要仪器

4.2实验方法

4.2.1 27种药物对CYP2C8.1的紫杉醇6α-羟基化催化反应的抑制程度检测

4.2.2药物对CYP2C8.1的紫杉醇6α-羟基化催化反应的半数抑制常数(IC50值)检测

4.2.3体内药物相互作用风险预测

4.2.4数据分析

4.3结果

4.3.1 10大类27种待测药物在32μM时对CYP2C8.1的紫杉醇6α-羟基化催化反应的抑制程度

4.3.2药物对CYP2C8野生型和5个CYP2C8突变体的半数抑制常数(IC50值)的检测结果

4.3.3体内药物相互作用风险预测结果

4.4讨论

4.4.1 10大类27种待测药物对CYP2C8.1的抑制作用分析

4.4.2 CYP2C8抑制剂对CYP2C8野生型和5个CYP2C8突变体抑制程度差异的分析

第五章基于荧光底物的CYP2C8抑制剂高通量筛选方法的初步建立

5.1材料

5.1.1主要试剂

5.1.2主要溶液

5.1.3主要仪器

5.2实验方法

5.2.1 CYP2C8野生型和5个突变体催化荧光底物BOMCC的Km值检测

5.2.2药物对CYP2C8催化荧光底物BOMCC抑制作用的检测

5.2.3半数抑制常数(IC50值)的计算

5.3结果

5.3.1 CYP2C8野生型和5个突变体催化荧光底物BOMCC的Km值

5.3.2药物对CYP2C8野生型和5个突变体催化荧光底物BOMCC抑制作用的高通量检测

5.4讨论

全文总结

参考文献

附录：缩略语表

致谢