硒对大骨节病区小麦内生真菌几种有毒代谢物的影响

摘要

大骨节病(Kashin-Beck Disease，KBD)是一种变形性的，慢性地方性骨关节疾病，对人体有极大危害，但其发病机制至今尚未完全明了。本实验室近年来的研究发现，适宜浓度的硒可能会使一些真菌菌株的产毒能力受到抑制，进而使它们的发酵产物对离体培养软骨细胞的毒性减弱;真菌毒素对软骨细胞的毒损作用可能是由多种毒素共同作用导致的结果。本实验在上述结果的基础上开展了进一步的研究工作。
　　本实验选取青海大骨节病区穗期小麦中分离的优势内生真菌梨孢镰孢霉(Fusariumpoae)和互隔链格孢霉(Alternaria alternate)进行实验，通过有机溶剂萃取、硅胶柱层析、薄层层析、高效液相色谱、液质联用等方法对其发酵产物进行逐级分离和分析。并对不同毒素组合及硒与蛇形菌素对兔膝软骨细胞的影响进行了探究，主要采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞的存活率，蛋白质免疫印迹法(Western blot)和免疫组化法检测兔二型胶原蛋白的合成量，甲苯胺蓝染色法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测兔蛋白聚糖的合成量，半定量RT-PCR法和荧光实时定量PCR法检测兔二型胶原蛋白与蛋白聚糖的mRNA表达量。
　　实验结果显示，在实验所设浓度范围内，当硒含量在20mg/L时，T-2毒素和蛇形菌素(DAS)的产量最低;当硒含量在5mg/L时，链格孢酚单甲基乙醚(AME)的产量最低。相对于无硒处理，所有加硒实验组的T-2毒素、DAS和AME产量都有不同程度的降低。
　　不同毒素组合对兔软骨细胞的影响实验显示，在相同浓度条件下，被测的单一毒素对细胞的毒损作用从大到小依次为T-2毒素、DAS、AME;毒素组合对细胞的毒损作用从大到小依次为T-2毒素与DAS、T-2毒素与AME、AME与DAS。相对于单一毒素，含有AME的毒素组合对兔软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和二型胶原蛋白mRNA的表达量均产生较小的抑制作用。
　　不同浓度的硒与DAS组合对软骨细胞的影响显示，在硒浓度低于1mg/L与DAS浓度低于0.02mg/L的范围内，DAS对兔软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和二型胶原蛋白的合成及其mRNA表达量等各项指标的影响大于单纯硒，对细胞表现出最大保护作用的组合为0.05 mg/L硒与0.001 mg/L DAS。结果提示适宜浓度的硒可在一定程度上减轻DAS对软骨细胞的损伤。
　　这些实验结果表明，硒元素对真菌产生的能够损伤软骨细胞的T-2毒素、DAS和AME的产生能力均有不同程度的抑制作用，并可一定程度上减轻DAS对软骨细胞的毒损作用。不同真菌毒素组合后可对软骨细胞的损伤产生一定的协同效应。结果提示从真菌代谢和环境因素的关系入手，也许会对目前大骨节病病因的研究提供新的思路。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 生物地球化学说

1．2 真菌毒素中毒说

1．2．1 T-2毒素

1．2．2 丁烯酸内酯

1．2．3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇

1．2．4 蛇形菌素

1．2．5 链格孢霉毒素

1．3 水中有机物中毒说

1．4 植物内生真菌

1．5 本课题的研究目的与意义

第二章 硒对相关毒素产生茵发酵产物中T-2毒素、DAS和AME产量的影响

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂及配制方法

2．2 实验方法

2．2．1 梯度硒条件下实验菌株的发酵与发酵液处理

2．2．2 待测样品的制备

2．2．3 HPLC鉴定比较

2．3 实验结果

2．3．1 硒对T-2毒素产量的影响

2．3．2 硒对DAS产量的影响

2．3．3 硒对AME产量的影响

2．4 讨论

第三章 梨孢镰刀菌发酵产物的分级提取纯化

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂及材料制备方法

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 菌株的发酵

3．2．2 发酵产物的分级提取

3．2．3 产物的进一步纯化

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 石油醚萃取物柱层析分离的TLC分析结果

3．3．2 F样品的HPLC分析结果

3．3．3 F1的气相色谱-质谱联用分析结果

3．3．4 F13的液相色谱-质谱联用分析结果

第四章 不同真菌毒素组合对软骨细胞的影响

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂及其配制方法

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 实验分组

4．2．2 兔膝软骨细胞的培养

4．2．3 MTT法检测细胞存活率

4．2．4 免疫印迹法测定二型胶原蛋白的表达量

4．2．5 免疫组织化学法检N--型胶原蛋白的表达量

4。2．6 甲苯胺蓝染色法检测蛋白聚糖的表达量

4．2．7 酶联免疫吸附法法检测蛋白聚糖的表达量

4．2．8 实时定量PCR法测定二型胶原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表达量

4．2．9 半定量RT-PCR法检测二型胶原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表达量

4．3 实验结果

4．3．1 毒素组合对软骨细胞存活率的影响

4．3．2 毒素组合对软骨细胞二型胶原蛋白表达的影响

4．3．3 毒素组合对软骨细胞蛋白聚糖表达的影响

4．3．4 毒素组合对软骨细胞二型胶原蛋白和蛋白聚糖mRNA表达量的影响

4．4 讨论

第五章 蛇形菌素与硒对软骨细胞的影响

5．1 实验材料与仪器

5．2 实验方法

5．2．1 实验分组

5．2．2 相关指标检测同第四章 4．2 部分

5．3 实验结果

5．3．1 DAS和Se对软骨细胞存活率的影响

5．3．2 DAS和Se对软骨细胞二型胶原蛋白表达的影响

5．3．3 DAS和Se对软骨细胞蛋白聚糖表达的影响

5．3．4 DAS和Se对软骨细胞二型胶原蛋白和蛋白聚糖mRNA表达量的影响

5．4 讨论

小结

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

致谢