陕西不同生态区土壤细菌及固氮微生物多样性分析

摘要

土壤微生物是构成土壤微生态系统的主要部分，通过对土壤微生物的多样性研究可以更好的发现微生物与土壤之间的相互作用机制。土壤微生物在改良土壤环境、优化生态结构、维持生态系统稳定、修复土壤污染、退耕还林还草和治理荒漠化等生态环境保护中具有重要作用。本研究分析了黄土高原(LP)、毛乌素沙地(MUSL，MU)、秦岭北坡(NSQLM，NS)和秦岭南坡(SSQLM，SS)四个分布在陕西境内的不同生态区好氧固氮菌及土壤细菌的群落结构多样性。
　　首先对不同生态区土壤中可培养的好氧固氮菌目进行了统计，结果发现，SS和MU之间菌落数量呈现极显著差异(P＜0.01)，LP和MU、LP和SS两组间菌落数量存在显著差异(P＜0.05)。每个生态区中选6个土壤样本，根据菌落形态差异，共分离出97株固氮细菌，并对其16SrDNA进行了测序，结果表明它们归属于27个属，其中主要优势菌属所占比例分别为假单胞菌属（Pseudomonas）11.34％、节杆菌属(Arthrobacter)10.30％、氏菌属(Bosea)8.25％、马赛菌属(Massilia)7.21％、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）7.21％、根瘤菌属（Rhizobium）6.10％。通过研究所分离固氮菌株对小麦根系的促生作用，发现LP4.4-SZ4（Arthrobacter）、NS2.1-SZ1(Burkholderia)两株菌能促进小麦根系生长，且NS2.1-SZ1促生作用较强。分别对不同土壤样本中固氮菌多样性和4个生态区的土壤理化性质进行了相关性分析，结果发现MU组内样本物种组成最相似且分布均匀，LP组内样本物种组成比较相似，而NS/SS组内样本物种组成不相似且分布不均匀。CCA分析结果表明土壤理化性质(pH/TC/TN/TP)在一定程度上影响了不同生态区土壤中自生固氮菌的分布，其中土壤pH对固氮菌的分布影响最大。PCA分析结果表明两个主坐标轴共反映了不同生态区内88.8％物种变异，且PC1解释了不同生态区间62.1％的物种组成差异，PC2解释了不同生态区间26.7％的物种组成差异，由此说明这四个生态区的固氮菌组成分布具有差异性。
　　同时，还对四个生态区不同土壤样品的细菌多样性进行了分析，分别提取细菌基因组，高通量测序研究发现各分组间获得有效序列数和OUTs数目无显著差异(P＞0.05)，但是物种注释TOP10的物种丰度存在显著差异(P＜0.05)。在细菌门分类水平上，放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和变形菌门（Proteobacteria）是四个不同生态区中三大主导细菌类群，其余细菌类群的丰度则和生态区域的土壤类型具有相关性。微生物α-多样性指数分析表明SS和MU组在微生物群落组成多样性和物种相对丰度以及整体遗传谱系组成均存在显著性差异(P＜0.05)，而其余分组间则无显著性差异;微生物β-多样性指数分析结果显示由主成分PC1产生的差异率为30.32％，并且SS组和MU组内样本微生物群落结构相似性较高，组间微生物群落结构相似性差异显著，这与α-多样性分析结果一致;而由主成分PC2产生的差异率为23.65％，LP组和NS组内部分样本与SS组和MU组所有样本在PC2上存在差异，两个主成分共产生53.95％的差异率。理化-关键物种相关性(CCA)分析结果表明pH、TN和TC是影响细菌分布和组成多样性的关键因素，其中厚壁菌门（Firmicutes）、WS3、硝化螺菌门（Nitrospira）、浮霉菌门（Planctomycetes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）和pH、TN和TC之间呈正相关性。土壤理化性质不仅影响微生物群落的分布，也会改变微生物群落结构多样性。

目录

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摘要

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表格索引

缩略语对照表

第一章 土壤微生物多样性研究综述

1．1 土壤固氮微生物多样性

1．1．1 固氮资源的开发和应用

1．1．2 生物固氮作用机制

1．2 土壤微生物多样性研究技术方法

1．2．1 以生物技术和化学检测为基础的分析方法

1．2．2 以现代分子技术为基础的微生物多样性研究方法

1．2．3 固氮菌多样性研究方法

1．3 土壤、植被类型与土壤微生物之间的相互作用关系

1．3．1 不同植被类型中土壤微生物群落多样性

1．3．2 植被类型、土壤类型与土壤微生物相互作用关系

1．3．3 土壤环境污染对微生物多样性的影响

1．4 本研究的主要内容和意义

1．4．1．主要研究内容和意义

1．4．2 本论文主要技术路线

第二章 土壤可培养固氮菌多样性研究

2．1 实验材料

2．1．1 土壤样品的采集与保存

2．1．2 主要试剂与培养基

2．1．3 PCR引物

2．1．4 实验相关仪器

2．2 实验方法

2．2．1 土壤理化性质测定

2．2．2 自生固氮菌的分离与鉴定

2．2．3 16SrDNA基因文库的构建

2．2．4 16SrDNA序列数据分析

2．2．5 高效固氮菌对小麦的根际促生作用

2．3 实验结果分析

2．3．1 24个土样理化性质测定

2．3．2 不同样品中可培养自生固氮菌落数

2．3．3 菌株分离保存与革兰氏染色鉴定

2．3．4 不同生态区可分离自生固氮菌系统发育关系

2．3．5 不同生态区已分离自生固氮PCA／CCA分析

2．3．6 分离固氮菌对小麦根系的促生长作用

2．4 小结与讨论

第三章 土壤样本中细菌多样性研究

3．1 实验方法

3．1．1 24个土样细菌总DNA提取与电泳检测

3．1．3 不同生态区土壤细菌群落生物信息分析

3．2 实验结果与分析

3．2．1 OUTs数目统计与物种注释分析

3．2．2 不同分组细菌群落α多样性分析

3．2．3 不同生态区分组间细菌群落β多样性分析

3．2．4 不同分组细菌群落PCA／CCA分析

3．3 结论与讨论

第四章 全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

致谢