肝癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的构建及其耐药机制的初步研究

摘要

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种世界性的恶性肿瘤，其发病率随着环境和生活方式的改变而逐年增高。针对肝癌晚期患者，化学疗法是一种有效的治疗手段。
　　而5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)作为首选的一线化疗药物之一，常在临床上被用于治疗肝癌晚期患者。但是，在长期使用的过程中，患者易对5-氟尿嘧啶等常规化疗药物产生耐药性，从而导致治疗效果减弱甚至失效。现阶段对于5-氟尿嘧啶在肝癌中的耐药机制仍不完全清楚。
　　本实验旨在筛选出与5-氟尿嘧啶的耐药机制密切相关的基因和信号通路。
　　使用浓度梯度递增的方法药物诱导人肝癌HepG2细胞，再通过有限稀释法得到了由单细胞衍生而来的两种细胞株，分别为HepG2敏感细胞株和HepG2/5-FU耐药细胞株。
　　利用转录组测序(Transcriptome Sequencing，RNA-Seq)技术，我们得到了这两个细胞株样品的转录组信息（总共检测了21409个基因），随后分析了这两个样本中的基因表达量，并筛选出641个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），包含350个上调基因和291个下调基因。
　　在完成对基因的功能注释和富集分析之后，我们发现，共有13个差异表达基因被富集到了Wnt信号通路，其中三个基因具有上下游关系且其表达差异符合预期，它们分别为Wnt通路抑制因子1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor1，DKK1)、卷曲受体10（frizzled class receptor10，FZD10）、和人散乱蛋白1(dishevelled segment polarity protein1,DVL1)。
　　随后，采用实时荧光定量PCR(q-PCR)验证了测序结果的可靠性以及三个Wnt信号（DKK1、FZD10和DVL1）的表达差异。
　　最后，利用siRNA干扰技术验证了这三个Wnt信号与HepG2细胞5-FU耐药之间的关联。
　　在本研究中，我们筛选出三个新的生物标志物（DKK1、FZD10和DVL1）（位于Wnt信号通路中），其表达调控与肝癌5-FU耐药性密切相关。
　　研究表明，Wnt信号通路在肝癌5-FU耐药性的形成过程中可能起到了重要的作用，这为肝癌耐药患者的个体化治疗提供了一个潜在靶点。

目录

声明

摘要

前言

第一章 绪论

1．1 肝癌简介

1．2 肝癌的治疗

1．2．1 肝癌的传统治疗手段

1．2．2 肝癌的生物治疗手段

1．3 肝癌的相关分子机制

1．4 肝癌的化疗耐药

1．5 肝癌一线化疗药物5-FU简介

1．6 转录组测序

1．7 Wnt信号通路的研究概况

1．7．1 Wnt信号通路

1．7．2 Wnt信号通路与HCC

1．7．3 基因DKK1、FZD10、DVL1与肿瘤化疗耐药的关系

1．8 本课题的意义

第二章 肝癌耐药细胞株的构建

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 细胞实验的前期工作

2．2．2 细胞实验的基本操作

2．2．3 药物诱导

2．2．4 单细胞筛选

2．2．5 CCK-8实验检测IC50

2．3 结果

2．3．1 细胞学形态的差异

2．3．2 细胞耐药结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 细胞样本的转录组测序

3．1 转录组测序的简介

3．2 测序的流程

3．2．1 提取样本RNA

3．2．2 测序文库的构建

3．2．3 上机测序

3．3 数据处理与分析

3．3．1 质控分析和数据组装

3．3．2 序列比对

3．3．3 基因表达量的分析

3．3．4 差异表达基因的筛选

3．3．5 功能注释

3．3．6 通路富集分析

3．4．2 差异表达基因的筛选结果

3．4．3 功能注释和富集分析结果

3．5 讨论

3．6 小结

第四章 mRNA表达水平的验证

4．1 q-PCR的简介

4．2 材料

4．3 方法

4．3．1 细胞RNA提取

4．3．2 逆转录实验

4．3．3 q-PCR对mRNA的验证

4．4 结果

4．4．1 RNA样本结果

4．4．2 mRNA验证结果

4．5 讨论

4．6 小结

第五章 转染细胞实验研究DKK1、FZD10和DVL1与肝癌5-FU耐药的关联

5．1 前言

5．2 材料

5．3 方法

5．3．1 q-PCR法检测siRNA的干扰效率并筛选siRNA序列

5．3．2 CCK-8法检测细胞在RNA干扰前后IC50的变化

5．4 结果

5．4．1 siRNA干扰效率及序列筛选的结果

5．4．2 CCK-8实验结果

5．5 讨论

5．6 小结

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

致谢