流式细胞术检测NK细胞信号通路磷酸化的方法建立及其初步应用

摘要

目的:该实验采用了NK细胞作为研究的主要细胞.自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是在20世纪70年代初被发现的.当时人们在肿瘤免疫研究中发现来自正常机体淋巴细胞可以杀伤某些肿瘤细胞,随后证实这些淋巴细胞的杀伤作用是天然的,无须有抗体存在或预先致敏,因此将其命名为自然杀伤细胞.与T、B细胞不同,NK细胞不表达典型的T、B细胞的表面标志(TCR、BCR).多种细胞因子受体介导的信号转导对NK细胞的发育分化以及功能有重要的调节作用.其中IL-15对NK细胞的发育、成熟起最关键的作用,IL-15还能刺激NK细胞增殖、明显提高NK细胞的细胞毒活性、共刺激NK细胞分泌多种细胞因子和趋化因子、调节NK细胞/巨噬细胞相互作用、协调外周NK细胞动态平衡等.我们选用IL-15作为NK细胞的刺激剂来研究其对NK细胞信号通路的影响.结论:1.流式细胞术可以用于检测胞内信号分子;2.IL-15能够活化NK细胞系的ERK1/2信号途径,而且这种活化具有时间和剂量依赖性,但是IL-15对p38 MAPK、JNK、Akt(Thr308)、Stat1通路没有影响;3.IL-15能够活化外周血NK细胞的ERK1/2信号途径,但是对同时检测的p38 MAPK、JNK、Akt(Thr308)、Stat1通路没有影响;4.U0126能够抑制IL-15对NK细胞ERK1/2信号途径的活化;5.流式分析表明NK-92细胞和K562细胞可以相互结合;6.流式分析表明NK-92细胞和K562细胞相互结合可以活化NK细胞的ERK1/2、p38 MAPK和JNK途径.

目录

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主要符号表

前言

实验材料和方法

一、主要的实验材料

1.1细胞系

1.2外周血

1.3细胞因子

1.4培养基及血清

1.5制备单个核细胞的试剂

1.6 FACS标记和检测的试剂

1.7胞浆蛋白提取用试剂

1.8 Western Blotting试剂

二、主要试剂的配制

三、主要实验仪器

四、主要的实验方法

4.1细胞培养

4.2细胞的冻存与复苏

4.3外周血单个核细胞的分离

4.4细胞计数

4.5苔盼蓝拒染法测细胞活力

4.6外周血单个核细胞培养

4.7 FACS检测细胞内信号分子

4.8全细胞提取物的制备

4.9蛋白质的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

4.10 Western Blotting检测磷酸化的蛋白质

4.11细胞的CFSE染色

4.12统计学处理

结果

一、流式细胞术检测胞内信号分子方法的建立

1.利用流式细胞术检测单一细胞的胞内信号分子

2.利用流式细胞术检测混合细胞体系内的胞内信号分子

3.利用Western Blot鉴定实验结果的正确性

二、IL-15对NK细胞信号通路的影响

1.IL-15对NK细胞系信号通路的影响

2. IL-15对外周血NK细胞信号通路的影响

三、效靶细胞相互作用对NK细胞信号通路的影响

1.流式分析表明NK-92细胞和K562细胞可以相互结合

2.流式分析表明NK-92细胞与K562细胞结合能活化ERK1/2途经

3.流式分析NK-92细胞与K562细胞结合对NK细胞系其他信号通路的影响

讨论

一、信号通路研究的意义及常用研究方法

二、流式细胞仪的工作原理及流式细胞术检测胞内信号分子的优越性

三、IL-15信号通路在NK细胞功能调节中起重要作用

1IL-15和IL-15受体的特征

2 IL-15的信号转导通路

3. IL-15在NK细胞功能调节中的作用

4 MAPK信号通路与NK细胞功能的关系

结论

致谢

参考文献

综述 IL-2和IL-15在肿瘤免疫治疗中的作用

攻读学位期间的研究成果