流式细胞术检测中性粒细胞膜碱性磷酸酶方法的建立及初步临床应用

摘要

目的：
　　应用荧光标记特异性抗碱性磷酸酶抗体和QuantiBRITETM PE定量系统，建立流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测中性粒细胞膜碱性磷酸酶（alkaline phosphatase on the surface membrane of neutrophils，mNAP）表达的方法，并初步应用于细菌与病毒感染的鉴别诊断和血流感染的预测。
　　方法：
　　1．应用荧光标记特异性抗碱性磷酸酶抗体，建立FCM检测外周血mNAP表达的方法。运用QuantiBRITETM PE于流式细胞仪评估每个细胞结合的碱性磷酸酶抗体数(AB/c)，间接反映待测细胞mNAP的表达量。
　　2．观察肝素、乙二胺四乙酸二钾、柠檬酸钠3种抗凝剂，标本放置温度、时间以及血浆中碱性磷酸酶对mNAP检测结果的影响，评价方法精密度。
　　3．用所建方法检测481名健康人群外周血mNAP表达水平，对数据进行正态性检验，以2.5％～97.5%位数作为临床参考区间。
　　4．检测84例细菌感染患者和39例病毒感染患者外周血mNAP表达水平，分析两组间mNAP差异有无统计学意义。
　　5．收集2013年6月至2014年10月住院疑似血流感染而行血培养检查的298例患者的全血和血清。FCM检测mNAP，电化学发光法检测血清降钙素原（PCT），免疫散射比浊法检测C反应蛋白（CRP）。采用ROC曲线评价mNAP、PCT、CRP预测血流感染价值。
　　结果：
　　1．样本检测前，应用磷酸盐缓冲液洗涤可以有效消除血浆中碱性磷酸酶干扰。3种抗凝剂采集的标本对mNAP检测结果均无影响。标本室温或4℃放置，其mNAP在12 h内无明显变化。精密度实验结果，批内变异系数（CV）2.01%～3.33%，批间CV5.80%～6.00%。
　　3．481名健康成年人无论男女，外周血mNAP表达水平均呈非正态分布。男、女中位数（P25，P75）分别为1758（1378～2310） AB/c、1897（1369～3249）AB/c，性别之间差异无统计学意义（U=27140，P=0.2438）。以2.5%～97.5%位数为临床参考区间，结果为920.5～3493.0 AB/c。
　　4．细菌感染患者外周血mNAP表达水平13532（9756～16869） AB/c高于病毒感染患者1143（536～2012）AB/c以及健康对照人群1879（1399～2497）AB/c（H=221.5，P<0.01）。
　　5．298例患者中，根据病原微生物学证实感染109例，其中血培养结果为革兰氏阳性菌组43例，革兰氏阴性菌组66例，血培养阴性189例。mNAP预测血流感染的曲线下面积为0.878，诊断最佳切点为9899AB/c，敏感性为80.8%，特异性为84.1%，阳性预测值为74.6%，阴性预测值为88.3%。在mNAP、PCT与CRP三个指标中， mNAP预测诊断血流感染的效能最高，可作为血流感染诊断的生物标志物。
　　结论：
　　1.成功建立应用流式细胞术定量检测血mNAP表达水平的方法。操作简便、快速、结果准确，克服了NAP传统检测技术的缺陷，为临床常规检测提供一个可靠方法。
　　2.利用该法建立mNAP表达水平的临床参考区间；初步临床应用结果显示其在细菌与病毒感染的鉴别诊断中显示出良好的应用前景。对于血流感染的预测具有重要的临床价值，可作为血流感染诊断的生物标志物。mNAP有望成为有价值的细菌感染生物标志物而广泛应用于临床。