蛔虫抗菌肽Cecropin P1的克隆及其在大肠杆菌中的表达

摘要

目的：传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，迫使人们寻找新型的抗微生物制剂。抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP）是由动物、植物、昆虫以及人体基因组编码的具有抗生素样活性的肽类物质。它是机体免疫系统的重要成分，构成宿主防御病原微生物入侵的第一道屏障。抗菌肽除了具有分子量小、热稳定性好、免疫原性较低等特点，还由于其独特的化学结构，能有效抑杀真菌、病毒、细菌、寄生虫，而不易产生耐药性，能选择性杀灭肿瘤细胞，而对人畜毒副作用极小。因此，抗菌肽作为新药开发，具有广阔的前景。蛔虫是寄生于动物和人体内的线虫，从其体内分离到的抗菌肽Ceeropin P1显示有广谱的杀菌作用。本研究以蛔虫抗菌肽Cecropin P1为研究对象，利用基因工程的方法制备蛔虫抗菌肽，并进行了体外抗菌活性测定，为进一步研究其抗菌机理及应用研究打下基础。 方法：根据蛔虫抗菌肽CecropinP1基因序列和氨基酸序列，以及大肠埃希菌对编码同种氨基酸不同密码子的偏嗜性，对蛔虫抗菌肽CecropinP1编码基因进行改造，人工设计并合成了3条抗菌肽CecropinP1基因寡核苷酸片段，通过PCR扩增得到抗菌肽CecropinP1基因，将此基因克隆到原核表达载体pET30a中，然后将重组质粒pET30a-CecropinP1转化大肠杆菌BL21，含有正确重组质粒的阳性菌株经IPTG诱导进行表达，SDS-APGE电泳观察表达产物，琼脂扩散法检测表达产物体外抑菌活性。 结果酶切分析、DNA测序等证实Cecropin P1基因已被正确地插入pET30a中；重组表达质粒pET30a-CecropinP1在大肠杆菌BL21中成功地表达了CecropinP1蛋白；重组蛋白具有一定的抗菌活性。 结论成功构建了重组质粒pMD-18T-CecropinP1与pET-30a-CecropinP1，并在大肠埃希菌BL21（DE3）中以包涵体形式高效表达，并检测到CecropinP1对部分病原菌的抗菌作用，为进一步研究蛔虫抗菌肽CecropinP1奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表、氨基酸缩略符号表

声明

前言

1 材料与方法

1.1 试剂

1.2 仪器与器材

1.3 试剂的配制

1.4 方法

1.4.1 PCR引物的设计与合成

1.4.2 PCR扩增Cecropin P1 基因

1.4.33 ％琼脂糖凝胶电泳

1.4.4 Cecropin P1 基因PCR产物的回收与纯化

1.4.5 Cecropin P1 TA克隆载体的构建

1.4.6 pET-30 a-Cecropin P1 质粒的构建

1.4.7 重组质粒的诱导表达

1.4.8 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1.4.9 表达产物的纯化及复性

1.4.10 蛔虫抗菌肽基因原核表达产物的抗菌活性检测

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

附图

综述：抗菌肽研究进展

攻读学位期间获得的研究成果

致谢