中枢神经系统感染性疾病重要病原体寡核苷酸检测芯片的初步研究

摘要

中枢神经系统(CentralNervousSystem，CNS)感染性疾病是由多种病原体引起的严重威胁人类生命健康的病症，该种类型的疾病发病急，诊断困难，致死率高，这就要求对脑脊液中病原体进行快速准确的检测鉴定，以期早期采取有效的针对性治疗措施。由于不同的病原体感染，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂，给诊断带来困难，确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，长期以来病原体诊断主要依靠形态学检查、脑脊液细菌培养及组织学的方法，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒培养检测不但费时、费力，且敏感性和特异性差，远远不能满足临床要求，造成该类疾病的死亡率居高不下或病后严重的后遗症。为解决这一难题，多年来该领域的工作者在细菌学、免疫学、分子生物学以及微生物学等领域做了大量的工作，建立了许多新的病原体诊断技术。 以PCR技术为基础的各种分子生物学诊断技术，成为生物医学领域内最有价值的研究手段和病毒学诊断的金标准，已经广泛应用于临床标本的检测，为该类疾病的基因诊断带来了突破性进展，为从基因水平诊断脑脊液病原体奠定了基础。但PCR的方法虽然敏感性高，可同时检测多种病原体的数量有限。而生物芯片技术的发展则提供了一种解决这一问题的途径，本研究拟构建平行检测中枢神经系统感染的常见病原体的寡核苷酸芯片，并对其临床标本的检测进行应用评价。 研究目的： 以醛基化玻片为基片，构建一种用于检测巨细胞病毒(CMV)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒I型(HSVI)、结核分枝杆菌(TB)、EB病毒(EBV)五种常见病原体的寡核苷酸芯片，用于中枢神经系统疾病的主要病原体的病因学诊断，为临床治疗提供病因学依据。 研究方法： 1.根据病原体的特异性蛋白的相关序列设计五种病原体70mer寡核苷酸长探针，每种病原体设计两条探针。 2.优化70mer探针的芯片的点样浓度、点样后的固定方法，探索比较两种靶基因标记方法，并优化适合长探针的杂交液及各种杂交条件。 3.在优化的条件基础上，选择特异性好的探针构建不同种属多种病原体的寡核苷酸芯片，设计五种病原体的长探针寡核苷酸芯片。 4.用随机引物方法对靶基因进行生物素掺入标记，标记产物与芯片杂交后再与avidin-Cy3反应，对杂交阵列洗涤后扫描。 5.芯片的重复性和稳定性实验。 6.采用该寡核苷酸芯片对临床样本进行检测并与和PCR检测方法进行比较。 研究结果： 1.选择病原体具有特异抗原决定簇的蛋白编码序列设计得到70mer左右的长片断探针，通过标准菌株检测证明该检测芯片具有很好的特异性。 2.标记策略上我们比较了两种方法，发现对样品采用随机引物间接标记的方法，先掺入生物素，杂交后再与avidin-Cy3反应，这种方法较Cy3直接标记信号强度强，成本相对更低廉。 3.通过实验优化制备病原体长探针寡核苷酸芯片的制备方法，样品标记策略和杂交液及杂交温度，实验证明点样浓度在10μmol/L时就可获得满意的荧光强度。探针点样后37℃水合，在3600mJ条件下进行紫外交联固定效果最好。优化出的杂交液成分：50％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS，杂交时间为2h，杂交温度为65℃。这些条件为下一步制备多种病原体的寡核苷酸芯片检测系统奠定了基础。 4.以优化的条件制备的寡核苷酸芯片对临床标本的检测结果表明，制备的寡核苷酸芯片检测体系与PCR法的检测结果相比，两种检测方法没有显著性差异(p＞0.05)，且一致性较好(Kappa值均大于0.75)，可以获得理想的检测效果。 研究结论： 1.70mer寡核苷酸探针具有更好的特异性，本实验通过采用70mer的探针明显的提高芯片的稳定性和可重复性。 2.优化的五种病原体同时标记的策略为，采用随机引物掺入的方法将biotin掺入到待测序列中，标记产物与芯片杂交后，再与avidin-Cy3反应结合，能明显的起到放大检测信号的效果，使芯片具有更高的灵敏度。 3.本实验通过优化实验条件构建的五种病原体平行检测寡核苷酸芯片技术体系具有检测相对快速、方便、准确，可以高通量的检测临床样本而无须进行细菌培养，为中枢神经系统感染的病原体学检测提供了一种更有效方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

研究生导师和课题指导教师介绍

前言

1生物芯片技术背景

2生物芯片原理和技术流程

3生物芯片的研究现状及研究进展

4研究目的

第一章 70mer寡核苷酸探针设计和引物的设计

1.设计方法

1.1病原体的确定

1.2靶序列的确定

1.3病原体基因序列的检索

1.4引物的设计

1.5特异性探针的设计

2.结果

2.1靶基因的选择

2.2引物设计的结果

2.3探针设计的结果

3.讨论

4.结论

第二章靶序列的标记方法及杂交条件的优化

1.实验材料

1.1基因模板

1.2实验仪器

1.3试剂

1.4引物探针的处理

1.5试剂配置

2实验方法

2.1检测目的基因的质粒载体的构建

2.2芯片制备

2.3靶基因DNA标记方法

2.4玻璃基片寡核苷酸探针的固定化

2.5芯片杂交

2.6扫描及结果分析

3.结果

3.1靶基因的扩增

3.2探针浓度的确定

3.3水合温度对探针固定效果的影响

3.4 UV紫外交联的能量强度对探针固定的影响

3.5两种DNA标记策略的比较

3.6 PCR扩增cy3直接荧光标记与随机引物标记方法的比较

3.7杂交液与杂交时间、杂交温度对杂交效果的影响

4.讨论

5.结论

第三章中枢神经系统感染性疾病主要病原体检测芯片的构建

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.结果

2.1引物的验证及探针的优化

2.2寡核苷酸微阵列对靶基因检测敏感性优化

2.3特异性的检验

2.4重复性检验结果

3.讨论

4.结论

第四章中枢神经系统寡核苷酸芯片的初步应用

1.材料和方法

1.1实验仪器和试剂

1.2寡核苷酸芯片对临床样本的检测

1.3 PCR方法对临床样本的检测

1.4五种病原体检测的寡核苷酸芯片的临床应用评价

2.结果

2.1临床检验扫描结果

2.2两种方法检测CMV的结果比较

2.3两种方法检测HSV I的结果比较

2.4两种方法检测RV的结果比较

2.5两种方法检测TB的结果比较

2.6两种方法检测EBV的结果比较

3.讨论

4.结论

全文小结

参考文献

综述 蛋白微阵列的制备及其在病原体检测中的应用

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢