Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的表达及初步纯化

摘要

单纯疱疹病毒(herpessimplexviros，HSV)属于疱疹病毒科，是有包膜的双链DNA病毒。HSV主要通过接触传播，侵犯外胚层来源的组织(包括皮肤、黏膜和神经组织)。发生在内脏和中枢神经系统的HSV感染常常很严重，而且确认困难，HSV是目前公认的主要生物致畸因素之一，对其的检测具有重要的临床意义。目前普遍为临床采用的实验室检查方法是酶联免疫吸附法(ELISA)方法和双抗原夹心法检测HSV抗体(IgM和IgG)，而国内ELISA试剂盒主要用细胞培养的全病毒做抗原，常与其它疱疹病毒呈现交叉反应，所以，抗原的质量是影响病毒检测灵敏度和特异性的关键。单纯疱疹病毒有12种已命名的特异性的抗原糖蛋白，这些糖蛋白是特殊的病毒多肽，抗原性强、特异性好，可作为蛋白抗原用于检测病毒抗体。其中HSV糖蛋白G(gG)是HSV-1与HSV-2型间差异最大的一个糖蛋白基因，因此可作为HSV型特异性血清学诊断的标准抗原。本实验室前期已构建了PBV220-HSV-1-gG质粒，并转染了E.coliBL21，为制备HSV型特异性血清学诊断标准抗原奠定了基础，但是前期试验结果显示，目的蛋白的表达效果不理想。 本研究的目的和要解决的问题： 在本实验室已构建的工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21的基础上，提取质粒，对其进行转化，通过改变不同发酵条件，从而探索对重组蛋白HSV-1-gG高效表达，并优化表达HSV-1-gG蛋白的工程菌的发酵条件，提高目的蛋白的产率，探索纯化目的蛋白的路径，westernbloting鉴定目的蛋白的表达。为下一步研制重组蛋白HSV-1-gG诊断试剂盒、开发基因工程疫苗以及改善现有ELISA诊断试剂的灵敏性和特异性奠定基础。 研究方法： (1)将实验室保存的工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21菌体重新提取质粒，制备感受态细胞，将其转化，并经PCR和双酶切进行鉴定。 (2)将转化后的工程菌利用其氨苄青霉素抗性通过摇瓶培养、温控诱导表达重组蛋白HSV-1-gG。反复摸索实验条件以实现对目的蛋白的高效表达，并经Westernblotting实验鉴定。 (3)优化工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21发酵条件，将其发酵罐放大培养，发酵工程菌。 (4)发酵的工程菌经超声裂解法破裂，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。 (5)DEAE离子交换凝胶柱初步纯化目的蛋白。 研究结果： (1)工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21经重新提取质粒，用感受态细胞转化后，以PCR和双酶切实验鉴定，证明已转化成功。 (2)菌体经诱导后，成功表达了重组蛋白HSV-1-gG。经Westernblotting分析结果发现，有明显的目的蛋白条带出现，证明工程菌经42℃热诱导表达后产生的蛋白的确为HSV-1-gG蛋白。 (3)经过反复摸索，改变条件，成功上罐发酵了工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21。 (4)经DEAESepharose凝胶柱阴离子层析对重组蛋白HSV-1-gG初步纯化，纯化出目的蛋白，但纯度不理想。 结论： 在实验室已构建的工程菌基础上，对工程菌PBV220-HSV-1-gG/E.coliBL21经重新提取质粒，用感受态细胞转化后，较好地表达了目的蛋白，经Westernblotting分析证明，有明显的目的蛋白条带出现。发酵获得了大量菌体后对目的蛋白进行了初步纯化。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

研究生导师和课题指导小组成员

第一部分前言

1 单纯疱疹病毒的特殊结构-特异性包膜糖蛋白

2 单纯疱疹病毒的分子生物学研究

3 单纯疱疹病毒感染的检测现状

4 应用PCR技术进一步研究HSV的课题及方向

5 本实验前期工作介绍

6 本实验的工作重点及解决的问题

第二部分HSV-1-gG目的基因的表达载体PBV220的转化

1 实验材料

1.1菌株

1.2主要试剂

1.3 LB固体和液体培养基

1.4主要仪器

2 实验方法

2.1工程菌菌种的活化

2.2质粒提取

2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳

2.4 CaCl2处理法制备感受态细胞

2.5细菌转化及蓝白斑克隆的筛选

2.6包含HSV-1-gG目的基因质粒的鉴定

3 实验结果

3.1质粒提取结果

3.2阳性表达质粒PBV220-HSV-1-gG的PCR鉴定

3.3双酶切鉴定结果

4 讨论

5 结论

第三部分重组蛋白HSV-1-gG的表达及鉴定

1 实验材料

2 实验方法

2.1工程菌的活性及表达

2.2重组蛋白质SDS-PAGE

2.3 Western blotting鉴定重组蛋白HSV-1-gG

3 实验结果

3.1诱导工程菌表达重组蛋白HSV-1-gG

3.2 Western blotting实验

3.3重组蛋白含量分析

4 讨论

5 结论

第四部分重组蛋白HSV-1-gG的发酵及初步纯化

1 实验材料

2 实验方法

2.1发酵罐放大培养

2.2裂菌

2.3用DEAE离子交换柱初步纯化目的蛋白

2.4(NH4)2SO4分级沉淀法沉淀目的蛋白

2.5分析方法

2.6 Western blotting鉴定目的蛋白

3 实验结果

3.1工程菌放大发酵后表达目的蛋白

3.2超声仪裂菌

3.3纯化

3.4(NH4)2SO4分级沉淀法沉淀目的蛋白

3.5用Western Blot鉴定目的蛋白的表达

4 讨论

5 结论

参考文献

综述：单纯疱疹病毒研究现状

在读期间已发表的文章

致谢