海洋环境主要人致病性病原体寡核苷酸检测芯片的研制与应用

摘要

海洋环境中所有已知的人类致病性病毒均可能通过粪——口途径危害公众健康，许多人致病性病毒能够随着粪便被排放环境中，进而通过污水、地表径流进入海水环境中。世界上大部分人口居住在沿海地区，因此，废水经常被直接或间接的排入到近海，已经影响到人类和生态系统健康。若干研究表明，甲型肝炎病毒（HAV）、诺瓦克样病毒（NOV）、轮状病毒（ROV）、星状病毒（ASV）、以及肠道腺病毒（ADV）能够在海洋环境中被检测到。海洋环境中只要存在一个活的人致病性病毒粒子，就存在再次感染人的机会。三十年事故发生的数据表明调查海洋环境中的人类病毒是十分必要的。海洋环境受到人类致病性病毒污染将不断地成为一个重要的公众健康问题，了解和控制近岸环境中病毒污染的关键是应用有效的方法来检测和分析这些病毒。 为解决这一难题，多年来该领域的工作者在细菌学、免疫学、分子生物学以及微生物学等领域做了大量的工作，建立了包括细胞培养、免疫学方法、分子生物学检测方法在内的许多新的病原体诊断技术。以PCR技术为基础的各种分子生物学诊断技术，成为生物医学领域内最有价值的研究手段和病毒学诊断的标准，已经广泛应用于多种病原体的同步检测，为该类病原微生物的检测带来了突破性进展。但PCR的方法虽然敏感性高，可同时检测多种病原体的数量有限。而生物芯片技术的发展则提供了一种解决这一问题的途径，本研究拟构建平行检测海洋环境中常见的人致病性肠道病原体的寡核苷酸芯片，并且应用于对取自全国各海区的贝样的检测，并对检测结果与PCR检测结果进行比较，评价芯片检测的特异性和敏感性。 研究目的： 以醛基化玻片为基片，构建一种用于检测HAV、ROV、NOV、ASV、ADV五种常见病原体的寡核苷酸芯片，用于海洋人致病性肠道病毒病原体的检测和监测，对海洋环境和相应产品的安全性进行评估。 研究内容及方法： 1．根据病原体的特异性基因序列设计五种病原体70mer左右的寡核苷酸长探针。 2．优化70mer探针的芯片的点样浓度、点样后的固定方法，优化适合长探针的各种杂交条件。 3．在优化的条件基础上，选择特异性好的探针构建不同种属多种病原体的寡核苷酸芯片，设计五种病原体的长探针寡核苷酸芯片。 4．芯片的重复性和稳定性实验。 5．采用该寡核苷酸芯片对取自全国各海区的海水样本进行检测并与和PCR检测方法进行比较，进行特异性和灵敏性评价。 结果： 1．选择病原体具有特异性保守序列设计出70mer左右的长片断寡核苷酸探针，通过标准毒株检测证明该检测芯片的探针具有很好的特异性。 2．通过实验优化制备病原体长探针寡核苷酸芯片的制备方法，探针点样浓度和杂交液及杂交温度，实验证明点样浓度在10μmol/L时就可获得满意的荧光强度。探针点样后37℃水合，在3600mJ条件下进行紫外交联固定效果最好。优化出的杂交液成分：50％甲酰胺、5×SSC、0．5％SDS，杂交时间为9h，杂交温度为65℃。这些条件为下一步制备多种病原体的寡核苷酸芯片检测系统奠定了基础。 3．以优化的条件制备的寡核苷酸芯片对海水标本的检测结果表明，制备的寡核苷酸芯片检测体系与PCR法的检测结果相比，两种检测方法没有显著性差异（P>0．05），且一致性较好（Kappa值均大于0．75），可以获得理想的检测效果。 结论： 1．70mer寡核苷酸探针具有更好的特异性，本实验通过采用70mer的探针明显的提高芯片的杂交结果的稳定性和可重复性。 2．本研究构建的五种病原体平行检测寡核苷酸芯片技术体系具有检测相对快速、方便、准确，可以高通量的检测海水样本及海洋生物标本的污染情况，且无须进行培养，为海洋环境中的主要病毒的检测和海洋环境监测提供了一种高通量的平行检测，特异性好，灵敏度与PCR相当的的技术手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

前言

1.生物芯片技术背景

2.生物芯片原理和技术流程

3.生物芯片的研究进展

4.现有生物芯片研究中存在的问题与未来展望

第一章 五种海洋环境致病病毒70mer寡核苷酸探针和引物的设计

1.设计方法

1.1 病原体的确定

1.2 靶序列的确定

1.3 病原体基因序列的检索

1.4 引物的设计

1.5 特异性探针的设计

2.结果

2.1 五种病毒的靶基因的选择结果

2.2 引物选择的结果

2.3 探针设计的结果

3.讨论

4.结论

第二章 五种病毒靶基因的标记方法及杂交条件的优化

1.实验材料

1.1 实验仪器

1.2 试剂

1.3 引物探针的合成及配置

1.4 试剂配制

2.实验方法

2.1 检测目的基因的质粒载体的构建

2.2 芯片制备

2.3 星状病毒靶基因的标记方法

2.4 玻璃基片寡核苷酸探针的固定化

2.5 芯片杂交

2.6 芯片扫描及荧光定量分析

3.结果

3.1 靶基因的扩增结果

3.2 探针点样浓度的确定

3.3 UV紫外交联的能量强度的优化

3.4 杂交温度的优化

3.5 杂交时间的优化

4.讨论

5.结论

第三章 海洋环境主要人致病性病原体检测芯片的构建

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.结果

2.1 引物的验证及探针的优化

2.2 寡核苷酸微阵列对靶基因检测敏感性优化

2.3 特异性的检验

2.4 重复性检验结果

3.讨论

4.结论

第四章 海洋环境五种主要人致病性病毒检测芯片的初步应用

1.材料和方法

1.1 实验仪器和试剂

1.2 寡核苷酸芯片对样本的检测

1.3 PCR方法对贝类样本的检测

1.4 五种病原体检测的寡核苷酸芯片的应用评价

2.结果

2.1 五种病毒检测芯片在海洋环境贝肉标本的检测的代表性图像

2.2 两种方法检测HAV的结果比较

2.3 两种方法检测ROV的结果比较

2.4 两种方法检测NOV的结果比较

2.5 两种方法检测ASV的结果比较

2.6 两种方法检测ADV的结果比较

3.讨论

4.结论

全文小结

参考文献

综述：固相生物芯片表面化学修饰处理研究进展

攻读学位期间发表的相关论文

致谢