骨髓增生异常综合征患者血浆nm23-H1水平的变化及其临床意义的研究

摘要

目的:
　　 通过检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆nm23-H1蛋白水平,探讨其表达水平变化与MDS分型、发展及预后的关系。MDS是一组独立的具有异质性的克隆性造血干细胞疾病,其主要特征为无效造血所致的难治性血细胞减少和极易发展成白血病。MDS由于临床表现不典型,血液学改变复杂、缺乏特异性,其诊断和治疗比白血病更为困难。2002年WHO制订了MDS的新分型标准,代替了一直沿用的FAB分型。nm23基因是近年来分离鉴定的一种肿瘤转移抑制基因,与人类多种肿瘤的浸润和转移有关。该基因家族由8个成员构成,其中研究最多的是nm23-H1基因,它在体外具有抑制转移潜能而不影响原发肿瘤大小的能力。nm23-H1是目前最主要的肿瘤转移抑制基因,在乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肝癌和恶性黑色素瘤等患者癌组织中的表达水平与癌组织的转移潜能呈负相关,对肿瘤转移有抑制作用；但在多种恶性血液肿瘤中,如白血病、MDS、淋巴瘤,作为分化抑制因子的nm23-H1基因的过表达往往提示预后不良。设计本课题主要目的是首先对MDS患者进行WHO分型,通过流式细胞仪检测MDS患者免疫表型,然后检测MDS患者不同分型阶段以及治疗后不同缓解阶段血浆nm23-H1蛋白含量,以探讨血浆nm23-H1蛋白水平的变化与MDS分型、免疫表型、病情发展及预后的关系及其临床意义。
　　 方法：
　　 1.86例患者首先从临床表现、外周血及骨髓涂片形态学检查、免疫组织化学检测、免疫表型检测,部分患者行细胞遗传学检查确诊为MDS,然后按照WHO分型标准分组。
　　 2.免疫表型采用直接免疫荧光技术,流式细胞仪为肋公司FACS Calibur,荧光剂为异硫氢酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE)。单克隆抗体的选择包括髓系相关的CD13,CD14,CD15,CD33；淋系相关的CD3,C04,CD8,CD19,CD20；造血干/祖细胞相关的CD34,HLA-DR。以CD45/SSC双参数散点图设门,每测定管收集10000个细胞,测定结果以Cell Quest软件进行分析。除MPO≥1096为阳性外,其他抗原阳性率≥20％为阳性。
　　 3.采用酶联免疫法(ELISA)检测86例不同分型MDS患者血浆中nm23-H1蛋白含量,同时以50例正常健康人作对照。取静脉血5ml,肝素抗凝,离心提取血浆,-80℃保存。检测时取待测血浆在37℃环境下温育30min,首先取nm23-H1蛋白标准品1支,按照说明书,以稀释液和样品液进行标准品的倍比稀释,共稀释A～H8-管,标准品的浓度从A管250ng/ml到B管125ng/ml,C管62.5ng/ml,D管31.25ng/ml,E管15.6ng/ml,F管7.8ng/ml,G管3.9ng/ml,H管为零对照管。加样、加标准品、温育、洗板、显色、加终止液均严格按照试剂盒说明书操作,酶标仪测定450nm的OD值,样品孔OD值=各孔测定OD值-空白孔OD值,计算样品浓度。统计学处理:用SPSS10.0统计软件完成。采用成组比较t检验和配对比较t检验,P<0.05为差异有显著性。
　　 结果：
　　 1.免疫表型测定结果((x)±s):86例MDS患者分为低危组(RA+RARS+5q-综合征)37例,中危组(RCMD+RCMD-RS+MDS-U)25例,高危组(RAEB-Ⅰ+RAEB-Ⅱ)24例。三组造血干/祖细胞相关抗原CD34与HLA-DR的表达率均显著高于正常对照组(P<0.05)；高危组显著高于中危组,中危组显著高于低危组(P<0.05)。MDS三组髓系早期抗原CD13、CD33的表达率显著高于正常对照组(P(0.05),中危组高于低危组,高危组高于中危组。MDS组的髓系成熟抗原CD15的表达率低于正常对照组(P<0.05),高危组低于中危组,中危组低于低危组和正常对照组(P<0.01)。单核细胞表面相关抗原CD14的表达率中危组、高危组高于正常对照组(P<0.05),低危组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；MDS低危组患者T淋巴细胞抗原CD3、CD4、CD8表达率与对照组相比差异无显著性(P>50.05),B淋巴细胞抗原CD19、CD20在高危组表达明显低于正常对照组(P(0.01),显示随着MDS病情恶化,各组表达率逐渐减低。
　　 2.86例患者血浆nm23-H1蛋白测定结果((x)±s):MDS患者RA组血浆中nm23-H1蛋白水平为6.42±1.04ng/ml,PARS组6.76±0.87ng/ml、5q-综合征组6.73±0.82ng/ml,此三组患者血浆nm23-H1蛋白水平与健康对照组(6.16±O.41ng/ml)相比无显著性差异(P>0.05)；RCMD组20.68±1.95ng/ml、RCMD-RS组25.31±1.66ng/ml、RAEB-Ⅰ组41.50±3.87ng/ml、RAEB-Ⅱ组54.95±5.44ng/ml、MDS-U组19.43±3.51ng/ml,此五组患者血浆nm23-H1蛋白水平明显高于健康对照组(6.16±0.41ng/ml)(P<0.01)。所有患者(除5例死亡病例)治疗后一年内再次测定血浆nm23-H1蛋白,多数组测定值比治疗前有所降低；RA组、RARS组、5q-综合征组和MDS-U组治疗后与治疗前血浆nm23-H1蛋白水平无显著性差异(P>0.05)；而RCMD组、RCMD-RS组、RAEB-Ⅰ组和RAEB-Ⅱ组与治疗前相比有显著性差异(P<0.01)。治疗后患者按照WHO关于MDS缓解程度分组,完全缓解组血浆nm23-H1蛋白水平为6.68±1.21ng/ml,与健康对照组(6.16±0.41ng/ml)比较无显著性差异(P>0.05)；未缓解组为43.56±7.74ng/ml、已发展为急性白血病组为56.84±10.28ng/ml,与对照组比较则差异性显著(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.MDS各组造血干/祖细胞标志CD34、HLA-DR以及髓系早期标志CD13、CD33的表达率高于正常对照组,成熟髓系标志CD15的表达率低于正常对照组；且随低危组向高危组进展,CD34、HLA-DR、CD13、CD33的表达率逐渐增高,成熟髓系标志CD15的表达率逐渐降低。说明MDS造血干/祖细胞和髓系早期抗原表达增多,成熟髓系抗原表达减少；提示MDS异常克隆发生于造血干/祖细胞,且以髓系干细胞异常为主。随疾病进展,MDS的恶性克隆逐渐呈现优势性增长而对正常造血产生抑制,使骨髓中以异常的恶性克隆造血细胞为主。T淋巴系抗原CD3、CD4、CD8在MDS各组的表达率与正常对照组无显著性差异,B淋巴系抗原CD19、CD20在MDS各组的表达率低于正常对照组,随低危组进展至高危组,表达率进一步减低,说明MDS患者B淋巴系早期抗原减少。免疫表型检测结果不仅证实MDS是一组恶性克隆性造血干细胞疾病,而且有助于MDS正确诊断分型。
　　 2.nm23-H1蛋白在MDS各病期患者血浆中都有表达,表达水平均高于健康对照组。而且其表达水平随着病情进展增高,低危组低表达,与健康对照组无显著性差异；中危组、高危组高表达,与健康对照组差异性显著。说明nm23-H1蛋白表达水平与MDS分型及病情进展呈正相关,进一步说明nm23-H1是一种分化抑制因子,在造血祖细胞中nm23-H1有高表达,而在骨髓和淋巴分化期间其表达下调,它的高表达可抑制人白血病细胞的分化。
　　 3.治疗后再次检测,血浆nm23-H1蛋白在MDS患者不同病期表达水平均有所下降,各型患者治疗后与治疗前分别比较nm23-H1蛋白水平,RCMD组、RCMD-RS组、RAEB-Ⅰ组和RAEB-Ⅱ组与治疗前相比有显著性差异；中危组、高危组仍然明显高于健康对照组。说明nm23-H1水平与MDS患者治疗的疗效有关,它的表达与造血系肿瘤的恶性生长、分化阻断、耐药等有关,提示MDS患者中nm23-H1阳性及高表达者化疗敏感性较差,预后不良。
　　 4.治疗后MDS未缓解组和转白组nm23-H1蛋白含量均比健康对照组及缓解组明显增高,而且急性白血病组增高最为明显。在MDS的病程中,初次治疗时nm23-H1的表达水平较高,完全缓解组其表达水平下降,未缓解组rim23-H1表达水平较高,而转白组nm23-H1持续高表达。说明nm23-H1的表达与造血细胞的增殖和分化相关,监测nm23-H1表达水平的变化可以反映MDS的病情变化及预后情况,高表达者预后差、不易缓解,易发展为急性白血病。
　　 5.较高的nm23-H1表达水平与较高的白血病细胞侵润性或恶性程度、患者的预后不良、对初始化疗的不敏感性及总体存活率的降低呈密切的正相关性,nm23-H1与MDS病情发展的这种正相关性也提示了nm23-H1基因有可能成为治疗MDS、白血病等恶性血液肿瘤的一个有效分子靶点。