通过整合组学研究发现与肝癌发生发展相关的长非编码RNA

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的人类癌症之一。我国每年新发及死亡HCC病例约占全世界病例的一半以上。在我国，HCC患者中约80％是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）携带者。尽管医疗水平不断提高，HBV相关HCC患者的5年生存率仍然很低。发现和鉴定肝癌的致病基因，研究其与肝癌发生和发展之间的关系，不仅有助于阐明肝癌形成的机制，而且对于肝癌新的预防、诊断、治疗措施的研发都具有极为重要的意义。
　　长非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA。与其它的非编码RNA（如microRNA）相比，lncRNA具有更长的序列与更复杂的二级结构和三级结构。众多已有研究表明，lncRNA不仅在细胞周期、凋亡和分化等基本的细胞生物学过程中发挥调控功能，在癌症等疾病的发生发展过程中也发挥着重要作用。在癌症中，lncRNA的转录水平异常往往可以标志着疾病的进展程度，甚至可以用来预测个体的患病风险。
　　本课题的目标就是要通过“组学”技术以及生物信息学分析方法，系统发现和鉴定与肝癌发生发展相关的lncRNAs，为将来lncRNAs在肝癌中的作用和分子机制研究，以及基于lncRNAs的应用研究奠定基础。为此，我们收集了40例HCC患者的癌组织及其配对的癌旁组织样本，采用Affymetrix Exon1.0ST芯片与Array Star Human12x135k Long Non-coding RNA Array两种芯片，分别对这40对HCC样本的编码基因(mRNA)与lncRNA的转录水平进行了高通量检测，然后通过“整合组学”分析方法，整合分析编码基因表达谱和lncRNA表达谱数据，期望以此发现与肝癌发生发展相关的lncRNAs。
　　首先，我们采用RMA(Robust multi-array average)的方法对上述编码基因表达谱和lncRNA表达谱数据进行了预处理。通过对样本与表达谱数据的一系列质量控制，我们最终获得了包括76个样本、11，221个编码基因的表达谱数据与包括75个样本、23，726个lncRNA的表达谱数据。我们通过SVA(Surrogate variableanalysis)方法分析发现，在癌和癌旁组织间显著差异表达的编码基因共有1，212个，lncRNA共有362个。我们进一步又通过topGO、SPIA（Signaling pathwayimpact analysis）与GSEA（Gene set enrichment analysis）方法分别对编码基因的表达谱进行了GO分析、通路富集分析与基因集富集分析，分别显著富集了42个GO项、5条KEGG通路与231个MsigDB基因项。在这些得到富集的功能项中，急性炎症免疫反应、细胞周期与细胞代谢相关的基因项均有显著统计学意义。此外，我们发现GSEA的结果中包括了来自7项已发表HCC研究的20个基因项，并且其富集的趋势与文献报道一致，提示我们的表达谱数据是可靠的。
　　随后，我们使用GSEA方法对编码基因表达谱与lncRNA表达谱数据进行了整合分析。对362个差异表达的lncRNA的功能富集分析显示，其中的141个lncRNA共富集到了364个基因项。我们利用这一结果构建了lncRNA的功能矩阵，又进一步通过双向聚类的方法最终找到了4个功能模块，共涉及13个lncRNA。在上述4个模块中，有3个模块与细胞周期功能显著相关，剩余一个模块则与细胞代谢功能显著相关。我们通过SPIA方法对上述4个模块进行了进一步的注释，发现在3个与细胞周期相关的模块中还显著富集P53通路。我们还采用GSCA(Gene set co-expression analysis)方法证明了4个模块中的基因在我们自己的表达谱数据、GSE22058和GSE3500这三个独立的HCC表达谱数据集中均具有差异共表达模式，因而证明了这4个模块中基因的表达模式具有稳定性。
　　随后，我们下载了ENCODE计划中HepG2细胞系的5种组蛋白甲基化修饰类型的ChIP-Seq数据，用于注释上述4个模块中的13个lncRNA的转录状态。结果显示，在lncRNA-ASLNC18598的启动子区域存在H3K4me1与H3K4me2组蛋白修饰，在其转录区域存在H3K36me3组蛋白修饰，提示ASLNC18598是活跃转录的。随后我们根据密码子替换频率（Codon substitution frequency, CSF）算法自行开发了CSF++软件，用于lncRNA的蛋白编码能力的预测，结果显示ASLNC18598的编码能力较弱(CSF Score=2.30)，提示其是一个真实的lncRNA。GSEA方法的功能预测结果显示，ASLNC18598参与了对细胞周期的调控。同时也与DNA损伤修复(RESPONSE_TO_DNA_DAMAGE_STIMULUS，NES=1.81,FDR=0.040)和TP53通路(TANG_SENESCENCE_ TP53_ TARGETS_ DN,NES=1.80，FDR=0.080)显著相关。
　　近来已有众多研究表明，很多lncRNA可通过表观遗传调控方式发挥作用。因此，为了在我们的数据中发现和鉴定与表观调控相关的lncRNA，我们又制定了一个监督式功能模块图谱的分析策略。经过系列筛选，我们发现了41个与表观遗传调控相关的候选lncRNA。通过检查这些lncRNA的启动子区域与转录区域的组蛋白甲基化修饰、蛋白编码能力以及在GSEA富集分析中的可重复性，我们最终确定了lncRNA-ASLNC18342是一个最优的候选者。在下载自ENCODE计划的ChIP-Seq数据中，我们发现在ASLNC18342的转录区域存在H3K36me3组蛋白修饰;编码能力的预测结果显示，ASLNC18342的编码能力较弱(CSFScore=2.43)。因此，我们可以确定ASLNC18342是一个真实的lncRNA。其功能模块图谱与GSEA分析的结果都表明，ASLNC18342可能参与细胞周期的调控。通过蛋白结合能力的预测，我们发现ASLNC18342可能与MLL(Mixed lineageleukemia)家族的蛋白相互结合，从而介导靶基因启动子区域的H3K4me3组蛋白修饰。
　　本实验室后续功能研究已显示，通过RACE(Rapid amplification of cDNAends)实验，已经证实这两个lncRNA是真实存在的;通过细胞表型实验与小鼠动物模型实验，也已经证实了它们能显著影响细胞周期的进程、显著影响肝癌细胞系的成瘤能力。进一步的分子机制研究也表明，ASLNC18598可以与hnRNP-K蛋白相互结合，从而验证了其与P53相关的预测;ASLNC18342则可与MLL1蛋白相互结合，从而验证了其参与表观遗传调控的预测。
　　综上所述，通过整合分析肝癌组织的lncRNA与编码基因表达谱数据，我们先后筛选出了ASLNC18598与ASLNC18342这两个与细胞周期调控相关的lncRNA，证明了“整合组学”分析不失为一种发现新的肝癌相关lncRNA的强有力的策略。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 肝癌组织的编码基因和lncRNA表达谱研究

1．1 材料与方法

1．1．1 HCC组织样本的收集与表达谱实验

1．1．2 表达谱数据的预处理

1．1．3 表达谱数据与肝癌样本的质量控制

1．1．4 差异表达基因和lncRNA的检测

1．1．5 富集分析

1．2 结果

1．2．1 表达谱数据与样本的质量控制

1．2．2 差异表达基因的检出

1．2．3 差异表达lncRNA的检出

1．2．4 差异表达基因的GO富集分析

1．2．5 差异表达基因的通路富集分析

1．2．6 GSEA富集分析

1．3 讨论

第二部分 lncRNA功能模块的发现

2．1 方法与材料

2．1．1 lncRNA功能模块的发现

2．1．2 采用CSF算法预测lncRNA的蛋白质编码能力

2．1．3 模块通路富集分析

2．1．4 差异共表达模式的检验

2．1．5 ChIP-Seq数据的分析

2．2 结果

2．2．1 lncRNA功能模块的发现

2．2．2 长非编码RNA ASLNC18598的发现

2．3 讨论

第三部分 表观遗传相关lncRNA的发现与研究

3．1 材料与方法

3．1．1 表观遗传相关候选lncRNA的筛选

3．1．2 lncRNA与蛋白质结合能力的预测

3．1．3 ASLNC18342敲低前和敲低后的表达谱研究

3．1．4 Illumina芯片概况

3．1．5 芯片数据初步的质量控制

3．1．6 Illumina芯片数据的预处理

3．1．7 lllumina芯片数据的质量控制

3．1．8 RNAi数据的GSEA富集分析

3．2 结果

3．2．1 表观遗传相关候选lncRNA的筛选

3．2．2 长非编码RNA ASLNC18342的生物学功能的预测

3．2．3 ASLNC18342与蛋白质结合能力的预测

3．2．4 细胞表型实验验证

3．2．5 RNA Pull-down后质谱数据的分析

3．2．6 ASLNC18342敲低表达谱数据的分析

3．3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述 基因芯片数据分析技术

已发表论文

个人简历

致谢