白腐菌Coriolus versicolor漆酶及其在制浆造纸废水深度处理中的应用

摘要

漆酶(Laccase，EC1.10.3.1)是白腐菌降解木质素酶系中的重要酶之一，具有高氧化还原电位、不需要H2O2启动而以O2为电子受体，因而具有比其他几种木质素酶更实际的应用价值。杂色云芝菌是白腐菌中重要的一类，具有较高的漆酶分泌能力。 论文首先从液体和固体两种培养体系出发，探索不同培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响。液体培养体系下，白腐菌的最佳生长和漆酶分泌条件是缓冲体系起始。pH5.8、摇瓶转速为180rpm、装液量为100mL/500mL;在所有测试碳源中，葡萄糖为最佳碳源，在二糖中以蔗糖为碳源，漆酶酶活相对较高，而多糖如淀粉不利于漆酶的生产。在所有测试氮源中，硝酸氨和酒石酸氨组合为最佳氮源，氯化铵和尿素的效果次之，蛋白胨的效果最差。当C/N＞10:1即高碳低氮培养条件下，有利于漆酶的形成。芳香化合物诱导剂ABTS浓度为0.5-1mM时，对漆酶的生产影响最明显，与限氮培养基中产酶相比可提高酶活5倍，约为230IU/ml；0.5mM愈创木酚、1mM阿魏酸、0.05mM二甲基苯胺的添加也明显提高酶活，约提高2-2.5倍；0.01mM黎芦醇的添加可提高漆酶约1.6倍。由于酪氨酸具有酚类化合物的特点，也可作为一种无毒的天然漆酶诱导剂。菌株漆酶活力固体培养体系下明显低于液体培养体系下。 以液体基质培养为研究对象，对白腐菌漆酶的分离纯化和主要酶学性质进行研究。纯化倍数为15倍，回收率为20.4％，该漆酶分子量为30.03kD;最适反应pH为4.5，pH6.0左右稳定性最高；最适温度为65℃，在50℃以下稳定性好，当温度超过70℃时，漆酶开始失活，在80℃处理20分钟，漆酶完全失活。 对杂色云芝漆酶处理造纸废水条件的研究结果表明：杂色云芝菌高产漆酶优化培养基与杂色云芝漆酶对造纸废水脱色的最佳培养基一致，说明在造纸废水的脱色方面漆酶起到了至关重要的作用；研究结果表明，造纸废水脱色与菌体生物量不呈正相关。在适宜的条件下，杂色云芝菌培养产生的漆酶粗酶液可有效的对碱法木浆造纸厂二沉池出水进行深度处理。漆酶粗酶液处理废水的效率跟处理时间和酶用量的大小有关，同时也受反应体系的温度和pH值等因素的影响。在一定的反应体系下，废水中木素、CODcr和色度的去除率随处理时间的延长和酶用量的增加而增加。最佳处理条件为：处理时间5小时，酶液用量5IU/ml，pn7，温度55℃。在进水CODcr为268mg/l，木素含量为100mg/l，色度为186倍的条件下，处理后出水CODcr为48mg/l，木素含量16mg/l，色度为10倍。CODcr、木素和色度的降解率分别达82.1％，84％和94.6％。通过对比粗漆酶和纯漆酶对造纸废水中的木素的去除效果，发现在同样处理条件下粗漆酶的效果优于纯漆酶。 最后通过凝胶渗透色谱法测定了造纸厂二沉池出水中木素的分子量为3.12万，经纯漆酶液处理1小时后的木素的分子量为4.66万，经纯漆酶液处理2小时后的木素分子量为5.86万。实验结果表明：经过漆酶处理后，废水中木素的分子量明显变大，漆酶在反应中对木素起到了聚合作用，白腐菌Coriolusversicolor漆酶液在一定的条件下可以将造纸厂二沉池出水中的木素及其衍生物催化聚合从而使其沉淀去除，废水中的木素及其衍生物减少，从而使废水的色度和COD降低，进而为造纸废水中水回用提供可能。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1白腐菌及其酶系研究进展

1.1.1白腐菌的生物学背景

1.1.2白腐菌降解木质素及漆酶的重要作用

1.1.3产漆酶的白腐菌

1.2白腐菌漆酶的特性及催化反应机理

1.2.1白腐菌漆酶的特性

1.2.2漆酶的催化反应机理

1.2.3漆酶对木素的聚合作用

1.2.4漆酶的工业应用

1.3白腐菌漆酶的分离纯化

1.4白腐菌及其漆酶在造纸废水处理中的应用

1.5本论文的主要研究内容及重要意义

第2章白腐菌Coriolus versicolor的培养及产漆酶条件研究

2.1材料与方法

2.1.1试材

2.1.2实验方法

2.2结果与分析

2.2.1白腐菌的形态特征

2.2.2白腐菌Coriolus versicolor产漆酶曲线

2.2.3培养条件对Coriolus versicolor产漆酶的影响

2.2.4营养条件对Coriolus versicolor产漆酶的影响

2.3铜离子浓度对产漆酶的影响

2.4表面活性剂对Coriolus versicolor产漆酶的影响

2.5诱导剂对Coriolus versicolor产漆酶的影响

2.6本章小结

第3章白腐菌漆酶的分离纯化及酶学性质研究

3.1材料与方法

3.1.1试材

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1白腐菌Coriolus versicolor漆酶的分离纯化

3.2.2白腐菌Coriolus versicolor漆酶的分子量

3.3漆酶的酶学性质研究

3.3.1pH值对漆酶活性的影响及酸碱稳定性研究

3.3.2漆酶最适反应温度及热稳定性研究

3.4本章小结

第4章白腐菌Coriolus versicolor漆酶用于造纸废水脱色时的培养条件研究

4.1材料和方法

4.1.1菌种与水样

4.1.2实验试剂与仪器

4.1.3粗漆酶液的制备

4.1.4漆酶酶活的测定

4.1.5菌体生物量的测定

4.1.6白腐菌漆酶对造纸废水的降解脱色

4.1.7造纸废水脱色率的测定

4.2结果与分析

4.2.1氮源浓度对杂色云芝菌生物量、产酶活性及其对造纸废水脱色率的影响

4.2.2碳源对杂色云芝菌生物量、产酶活性及其对造纸废水脱色率的影响

4.2.3pH值对杂色云芝菌生物量、产酶活性及其对造纸废水脱色率的影响

4.3本章小结

第5章白腐菌Coriolus versicolor漆酶在造纸废水深度处理中的应用

5.1原料与方法

5.1.1原料

5.1.2粗漆酶液的制备

5.1.3漆酶的纯化方法

5.1.4造纸废水深度处理试验

5.1.5分析方法

5.2结果与讨论

5.2.1废水中木素含量、CODcr和色度随处理时间的变化

5.2.2酶用量对降低废水中木素含量、CODcr和色度的影响

5.2.3温度对降低废水中木素含量、CODcr和色度的影响

5.2.4pH值对废水中木素、CODcr和色度去除率的影响

5.2.5粗漆酶与纯漆酶对造纸废水中木素去除率的对比

5.3本章小结

第6章白腐菌Coriolus versicolor漆酶在木素催化聚合中的应用研究

6.1实验部分

6.1.1仪器设备

6.1.2原料和试剂

6.1.3色谱分析条件

6.1.4流动相的选择

6.1.5废水中木素的提取方法

6.1.6木素试样的乙酰化

6.1.7木素的催化聚合试验

6.1.8木素分子量和含量的测定方法

6.1.9纯漆酶液的制备

6.2结果与讨论

6.2.1从二沉池出水中提取木素

6.2.2反应时间对沉淀物产生量和木素去除率的影响

6.2.3木素催化聚合前后的分子量变化

6.2.4木素分子量多分散性

6.3本章小结

第7章 结论与展望

7.1本研究的主要结论

7.2本研究的创新之处

7.3下一步工作的计划

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文