利用合成的基因回路实现细胞水平上尿酸稳态控制的实验研究

摘要

合成生物学是后基因组时代新兴的一门综合性交叉学科，也是现代生命科学研究的热点领域之一。合成生物学主要是以传统生物学为基础，结合工程学、材料学、计算科学等其他学科技术，人工合成新的生物网络或系统，从而按照设计人员预想，表现出新的功能。近二十年来，合成生物学研究取得了长足的发展，其研究涉及生物医药、能源、材料、生物计算、军事应用等众多领域，为解决人类发展所面临的若干重大问题带来新的希望。
　　尿酸是嘌呤代谢的终产物，微溶于水，易形成尿酸盐晶体沉淀，是人体内主要的代谢产物之一，人体液中尿酸含量的变化可以反映出人体内代谢及免疫等身体机能的状况。人体内尿酸含量高于正常生理范围时称为高尿酸血症，长期的高尿酸血症易导致痛风、肿瘤溶解综合征等疾病。痛风是尿酸盐晶体在关节滑膜、软骨等组织沉积，引发的异物炎症反应。目前，针对痛风主要使用药物进行治疗，包括传统的别嘌醇等药物及新型的生物尿酸酶制剂等。传统药物安全性较好，但治疗效果不明显，且易引发严重的副反应;新型的生物尿酸酶制剂虽然具有快速、强大的降尿酸作用，但易诱发急性痛风发作，易引起超敏反应和耐药。合成生物学技术的发展，使研究人员看到了从基因、细胞水平上实现尿酸等代谢产物调控的曙光。有文献报导，耐辐射型球菌基因组中基因片段hucR，可翻译成具有转录抑制作用的蛋白HucR，在尿酸的介导下，HucR通过与基因hucO的相互结合或分离，进一步影响hucO下游基因的表达。
　　本研究的目的主要是以转录抑制物基因hucR及其结合位点基因hucO为基础，人工合成优化的转录抑制物基因mUTs及其结合位点的8串联结构基因hucO8，将mUTs和hucO8作为标准生物模块，构建具有尿酸感应及调控作用的基因回路，在细胞水平上研究回路对尿酸浓度的调控作用。主要研究内容及结果简要概述为以下几方面:
　　1、从NCBI数据库获取优化的转录抑制物基因mUTs及其结合位点的8串联结构基因hucO8的序列，优化的黄曲霉菌尿酸酶基因smUox的序列，进行化学合成，将含有目的基因mUTs、hucO8和smUox的载体分别命名为pMD18T-mUTs、pMD18T-hucO8和pGH-smUox。
　　2、以载体pcDNA3.1/V5-his(C)和pMD18T-mUTs为基础，构建优化的转录抑制物表达载体pcDNA3.1/V5-mUTs;以分泌型碱性磷酸酶(secreted alkalinephosphatase，SEAP)表达载体pSEAP2-control和载体pMD18T-hucO8为基础，构建含有8串联结构基因hucO8的报告基因表达载体pSEAP-hucO8;共转染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8组成的双载体回路至HeLa细胞，通过检测转染48 h后SEAP的表达量，验证了双载体回路的基本原理，证明了回路对尿酸具有一定的感应作用。
　　3、以双向共表达载体pBudCE4.1为基础，将基因片段mUTs和hucO8-SEAP整合至pBudCE4.1的两个多克隆位点区域，构建了双向共表达的单载体基因回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs，转染至HeLa细胞，通过检测转染48 h后SEAP的表达量，验证了单载体回路的基本原理，证明了单载体回路对尿酸具有一定的感应作用。6
　　4、以不同摩尔比的pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8或pcDNA3.1/V5-mUTs和pBudCE4.1-SEAP-mUTs共转染HeLa细胞，通过分析SEAP表达量的差异，研究mUTs和hucO8的比例对回路的影响，结果表明，一定范围内（本研究所用比例范围1∶1-4∶1），随着mUTs/hucO8的比例增加，mUTs对hucO8下游基因表达抑制作用逐渐增强，当mUTs/hucO8=4∶1时，mUTs对hucO8下游基因表达抑制作用最强。
　　5、以载体pSEAP-hucO8和pGH-smUox为基础，构建了优化的黄曲霉菌尿酸酶表达载体phucO8-smUox;再以载体phucO8-smUox和pBudCE4.1为基础，构建了优化的黄曲霉菌尿酸酶表达载体pBudCE4.1-smUox，转染至HeLa细胞，通过检测转染48 h后培养基中尿酸酶的含量，验证了smUox能在HeLa细胞中正确表达;最后以载体pBud4.1-smUox和pBudCE4.1-SEAP-mUTs为基础，成功构建了单载体尿酸调控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox。
　　6、单独转染单载体尿酸调控回路(pBudCE4.1-mUTs-smUox)或者共转染双载体尿酸调控回路（phucO8-smUox、pcDNA3.1/V5-mUTs），通过检测转染48h后培养基中尿酸含量，对比转染前后尿酸含量差异。证明了单载体回路和双载体回路均具有一定的尿酸调控能力。
　　本研究首先构建了双载体尿酸感应回路，通过检测转染后报告基因SEAP的表达量，验证了mUTs与hucO8的基本原理及回路对尿酸的感应作用，在此基础上，通过引入smUox，分别构建了双载体和单载体尿酸调控回路。相比于单载体回路，双载体回路的主要优点是可以自由控制转染时mUTs和hucO8的比例，但其同样具有以下几方面弊端:1.转染效率不确定，双载体回路在转染时无法准确控制转入HeLa细胞的mUTs和hucO8的比例;2.共转染实验操作相对复杂，实验成本相对较大;3.双载体回路在筛选稳定转染细胞系时，需要通过两个不同的筛选标记进行筛选，筛选难度相对较大，且筛选过程复杂。与之相比，单载体回路具有以下几方面优点:1.单独转染pBudCE4.1-mUTs-smUox代替了共转染pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs，简化了实验操作，节省了实验成本;2.单载体回路可以有效保证转入HeLa细胞的mUTs与hucO8的摩尔比，规避了转染效率不定等因素导致的mUTs与hucO8比例不确定问题;3.单独转染只需一个筛选标记，很大程度上方便了后续研究中稳定转染HeLa细胞系的筛选。
　　综上所述，本研究以mUTs和hucO8为标准生物模块，利用合成生物学的技术方法，成功构建了双载体及单载体尿酸调控回路，验证了回路的作用原理，证明了回路对尿酸具有感应及调控作用，实现了在细胞水平上对尿酸进行调控的目的。且研究发现，在一定范围内，生物模块mUTs与hucO8的摩尔比，会通过影响hucO8下游基因的表达，进而影响回路对尿酸的调控作用。前述研究为进一步实现细胞水平上尿酸的稳态控制奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第1章 前言

1．1 合成生物学发展概述

1．2 合成生物学的国内外发展现状

1．2．1 国外合成生物学研究进展

1．2．2 国内合成生物学研究进展

1．3 合成生物学在生物医药领域的应用

1．4 尿酸及高尿酸血症

1．4．1 尿酸

1．4．2 高尿酸血症及其治疗

1．5 选题依据与研究目的

1．5．1 选题依据

1．5．2 研究目的

1．6 主要研究内容

1．6．1 基础载体的构建

1．6．2 双载体基因回路的功能验证

1．6．3 单载体基因回路的构建与功能验证

1．6．4 基于smUox的基因回路构建与功能验证

1．7 技术路线

1．8 研究意义

第2章 基础载体的构建

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 主要试剂和试剂盒

2．1．3 培养基及其他溶液

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 化学合成基因片段mUTs和hucO8

2．2．2 质粒DNA化学转化至大肠杆菌DH5α感受态

2．2．3 单克隆挑取及菌液培养

2．2．4 菌液保存及复苏

2．2．5 大肠杆菌质粒DNA提取

2．2．6 质粒DNA双酶切鉴定

2．2．7 质粒DNA双酶切回收

2．2．8 DNA琼脂糖凝胶电泳

2．2．9 DNA凝胶片段回收

2．2．10 目的片段连接

2．3 实验结果

2．3．1 pMD18T-mUTs和pMD18T-hucO8酶切验证结果

2．3．2 pSEAP-hucO8的构建

2．3．3 pcDNA3．1／V5-mUTs的构建

2．4 小结

第3章 双载体基因回路的功能验证

3．1 实验材料

3．1．1 细胞株和质粒

3．1．2 主要试剂和试剂盒

3．1．3 培养基及其他溶液

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 HeLa细胞复苏

3．2．2 HeLa细胞传代培养

3．2．3 HeLa细胞冻存

3．2．4 细胞计数及接种24孔细胞培养板

3．2．5 转染用质粒提取

3．2．6 Lipofectamine 2000转染HeLa细胞

3．2．7 SEAP化学发光检测

3．2．8 MTT实验

3．3 实验结果

3．3．1 转染条件及检测时间摸索

3．3．2 回路基本原理验证

3．3．3 回路对尿酸感应作用分析

3．4 讨论

3．5 小结

第4章 单载体基因回路的构建与功能验证

4．1 实验材料

4．1．1 菌种质粒及细胞株

4．1．2 主要试剂和试剂盒

4．1．3 培养基及其他溶液

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 质粒DNA转化大肠杆菌DH5α感受态

4．2．2 单克隆挑取、菌夜培养及质粒DNA提取

4．2．3 PCR基因改造

4．2．4 PCR产物回收及连接T载体

4．2．5 DNA双酶切鉴定

4．2．6 DNA双酶切回收

4．2．7 目的片段连接

4．2．8 细胞计数、铺板及转染

4．2．9 SEAP化学发光检测

4．3 实验结果

4．3．1 PCR改造mUTs基因

4．3．2 pBudCE4．1-SEAP的构建

4．3．3 pBudCE4．1-SEAP功能验证

4．3．4 pBudCE4．1-SEAP-mUTs的构建

4．3．5 单载体回路基本功能验证

4．3．6 回路对尿酸感应作用分析

4．4 讨论

4．5 小结

第5章 基于smUox的基因回路构建与功能验证

5．1 实验材料

5．1．1 菌种和质粒

5．1．2 主要试剂和试剂盒

5．1．3 培养基及其他溶液

5．1．4 实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 基因smUox的化学合成

5．2．2 质粒提取

5．2．3 DNA双酶切鉴定

5．2．4 DNA双酶切回收

5．2．5 目的片段连接

5．2．6 细胞计数、铺板及转染

5．2．7 尿酸检测

5．2．8 尿酸酶检测

5．3 实验结果

5．3．1 尿酸和尿酸酶标准曲线

5．3．2 phucO8-smUox的构建

5．3．3 pBudCE4．1-smUox的构建

5．3．4 pBudCE4．1-smUox功能验证

5．3．5 pBudCE4．1-mUTs-smUox的构建

5．3．6 回路对尿酸调控作用分析

5．4 讨论

5．5 小结

总结与展望

总结

展望

参考文献

附录

文献综述

攻读硕士期间发表文章、申请专利、参与会议

作者简介

致谢